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羊传染性脓疮病毒ORF047酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定: 2024年; 为研究羊传染性脓疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF047编码IMV上的膜蛋白在病毒与宿主互作过程中的功能,本研究选择pBT3-N和pBT3-SET两种不同表达特性的诱饵载体,分别成功构建了pBT3-N-ORF047、pBT3-SET-ORF047和pBT3-SETORF047-183AA三个诱饵质粒,并进行自激活作用和对酵母毒性作用的检测。结果表明:用诱饵载体pBT3-N构建的诱饵质粒pBT3-N-ORF047可用于筛选羊睾丸cDNA文库,这为后续以ORF047膜蛋白和羊睾丸细胞膜文库为研究系统、筛选病毒与宿主互作蛋白的研究奠定了基础。; 宋世斌陈国华

剑麻AhMADS8937基因酵母双杂交诱饵载体的构建、毒性和自激活检测: 2024年; MADS-box是植物重要的转录调控因子,参与种子休眠和萌发、根系生长、花器官发育、果实成熟等营养生长和生殖生长过程。前期研究结果表明AhMADS8937可能参与调控剑麻株芽的发育。鉴于MADS-box蛋白能以复合体的形式调控植物发育,因此为筛选剑麻(Agave hybrid No.11648)中与AhMADS8937蛋白相互作用的蛋白,本研究构建了pGBKT7-AhMADS8937诱饵表达载体,酶切验证和测序结果表明载体构建成功。将重组载体转化Y2HGold酵母感受态,检测其对酵母菌株是否有毒性,以及是否存在自激活。结果表明pGBKT7-Ah MADS8937诱饵载体对Y2HGold酵母菌无毒性但存在自激活,5 mmol/L的3-氨基1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT)可抑制其自激活。本研究成功构建AhMADS8937酵母双杂交诱饵载体,为筛选与AhMADS8937相互作用的蛋白,解析剑麻株芽发育的分子调控网络打下基础。; 杨茜徐蕾汪询杨子平周文钊; 关键词：剑麻酵母双杂交诱饵载体

芒果R1MYB1转录因子的克隆及酵母双杂诱饵载体的构建: 2024年; MYB(Myeloblastosis)转录因子广泛参与植物次生代谢产物调控、细胞形态建成、逆境响应及生长发育等过程,同时也是植物原花青素生物合成过程中重要的调控因子。前期研究中,从芒果LAR基因酵母文库筛选中分离获得一个R1型MYB转录因子,命名为MiR1MYB1。为了研究芒果果实中原花青素合成机理,本研究通过PCR克隆获得MiR1MYB1 cDNA全长序列,其全长为1436 bp,开放阅读框为849 bp,编码282个氨基酸,蛋白分子量为31.25 kD,等电点为9.33。系统发育分析显示MiR1MYB1蛋白与黄林木具有较近的亲缘关系。将其序列定向克隆到酵母表达载体pNC-GBKT7并转化酵母Y2H Gold感受态细胞。对诱饵质粒进行自激活和毒性检测,pNC-GBKT7-MiR1MYB1没有自激活活性和毒性。此表达载体的构建也为后续筛选互作蛋白提供基础。; 蔡汝琼吕浩然王旭刚谭琳; 关键词：芒果基因克隆

橡胶树棒孢霉落叶病菌酵母单杂交cDNA文库及CcCas5启动子诱饵载体的构建: 2024年; 为了筛选出与CcCas5启动子结合的转录因子,本研究构建了橡胶树棒孢霉落叶病菌的酵母单杂交cDNA表达文库和CcCas5启动子诱饵载体,并对3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)的最佳抑制浓度进行了筛选。结果显示,构建的酵母单杂交cDNA表达文库总容量为3.49×10^(6)cfu,插入片段主要分布于750~2000 bp之间,重组率为95.8%;克隆了CcCas 5基因2600 bp的启动子序列,预测获得真菌主要的10大类转录因子的结合位点165个;构建了分别携带1500 bp和1000 bp启动子序列的酵母单杂交启动子诱饵载体,10 mmol/L的3-AT能抑制pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500的背景表达。试验结果为通过酵母单杂交筛选与CcCas5启动子结合的转录因子和进一步研究转录因子对CcCas5表达的调控作用奠定基础。; 胡国豪杨子平刘铜张荣意侯巨梅; 关键词：橡胶树多主棒孢启动子酵母单杂交 CDNA文库

剑麻AhKH1775基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建: 2023年; KH结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现AhKH1775可能参与调控剑麻株芽的发育,但是其调控机制仍不清楚。KH结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。为获得与AhKH1775相互作用的蛋白,本研究克隆了AhKH1775的完整编码框,构建了酵母双杂交诱饵载体,并检测了诱饵载体的毒性和自激活性。结果显示,克隆获得一个918 bp的编码框,成功构建了诱饵载体,诱饵载体无毒性,但存在自激活性,25 mmol/L的3-AT可以抑制诱饵载体的自激活性。本研究结果为进一步筛选与AhKH1775相互作用的蛋白和深入研究AhKH1775在剑麻中的功能提供依据。; 汪询杨倩柯智周文钊杨子平吕玲玲; 关键词：剑麻基因克隆酵母双杂交诱饵载体

菜用豌豆酵母单杂交cDNA文库及糖转运蛋白PsSWEET15诱饵载体构建被引量：2: 2023年; SWEETs(Sugars will eventually be exported transporter)是近年来新发现的一类重要的糖转运蛋白,调控植物体内的糖转运和分配过程。在菜用豌豆中,有关PsSWEETs基因功能及作用机制的报道甚少。本研究克隆获得了PsSWEET15启动子,长度为1182 bp。通过启动子作用元件分析,发现其含有种子特异表达元件GCN4 motif、光、无氧、乙烯、赤霉素等环境胁迫应答元件以及ERF、DOF、MYB、WRKY、NAC、NF-Y、TCP等多个转录因子结合位点。进一步构建了PsSWEET15启动子酵母单杂诱饵载体pPsSWEET15::HIS3以及菜用豌豆cDNA文库,库容为3.056×10^(8)CFU,插入片段平均长度约1000 bp。研究结果为后续筛选PsSWEET15基因上游转录调控因子并探究PsSWEET15基因调控机制提供了基础。; 冯志娟刘娜张古文卜远鹏王斌龚亚明; 关键词：菜用豌豆 CDNA文库

番茄分裂泛素酵母双杂膜系统cDNA文库及SlToc159诱饵载体的构建被引量：2: 2022年; 叶绿体是植物进行光合作用、脂质代谢以及氨基酸合成的重要场所。叶绿体自身基因组编码的蛋白质仅有100个左右,其余95%(约3000多个)的叶绿体蛋白质即前体蛋白是由细胞核基因组编码的,在细胞质中翻译后通过TOC-TIC转运蛋白复合体导入叶绿体的特定位置而发挥生物学功能。Toc159是叶绿体外膜转运蛋白,主要负责转运初始阶段前体蛋白的特异性识别。为研究番茄SlToc159与前体蛋白的互作机制,本试验以‘Alisa Craig’番茄为材料,提取番茄幼苗叶片总RNA,采用Gateway技术构建分裂泛素化膜系统cDNA文库,同时构建诱饵载体pBT3-N-Toc159AGM和pBT3-N-Toc159GM,并用营养缺陷法检测其自激活活性。文库质量检测结果显示,文库总容量为1.6×10^(7)CFU,文库滴度为4.0×10^(6)CFU·mL^(-1),外源基因插入片段为750~2000 bp,重组率为100%,符合后续筛选互作蛋白的cDNA文库要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pBT3-N-Toc159AGM和短截A区的pBT3-N-Toc159GM构建成功,能够在分裂泛素化系统中正确表达且无自激活活性。本研究结果为番茄膜蛋白利用酵母双杂交筛选互作蛋白提供参考与理论基础。; 王琪闫见敏闫见敏李云洲须文; 关键词：番茄 CDNA文库 GATEWAY技术诱饵载体

烟草NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选被引量：2: 2022年; 为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。; 谢瑞莹曾露桂姜超英聂琼; 关键词：酵母双杂交非生物胁迫

烟草NtCBT基因启动子酵母单杂诱饵载体构建及互作蛋白筛选被引量：2: 2022年; 为了筛选烟草类西柏烷生物合成途径中西柏三烯一醇合酶基因(NtCBT)的上游调控转录因子,将NtCBT基因启动子截为6段(P1-P6区域),分别构建酵母单杂诱饵载体pAbAi-Px,将pAbAi-Px转化Y1H酵母感受态细胞构建诱饵菌株并进行自激活检测,从烟草腺毛酵母cDNA文库中筛选与P5区域(-279--119 bp)互作的转录因子。结果表明,P1-P5区域所构建的诱饵菌株,在AbA浓度为200 ng/mL时转录自激活得到有效抑制;在以P5区域为诱饵菌株的筛库实验中,共获得49个阳性克隆,去除冗余序列后35个克隆为非重复序列,其中3个克隆注释为ANL2、ML1及NF-Y转录因子。以上结果为进一步研究NtCBT基因的表达调控机制奠定了基础。; 余婧杨慧余世洲赵会纳郑庆霞王兵雷波; 关键词：酵母单杂交启动子

陆地棉酵母双杂交cDNA文库及VdSCP7诱饵载体的构建被引量：6: 2021年; 由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNaseⅠ处理后,用RNA 5′末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×10^(6) CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×10^(9 )CFU·mL^(-1),满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。; 韦春艳秦腾飞董娜李玉青董涛郭婷孙家良王清连; 关键词：棉花诱饵载体大丽轮枝菌

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