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基于TPO18基因蛋白的兔豆状囊尾蚴感染间接ELISA检测方法的建立: 2024年; 豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫(Taenia pisiformis)的幼虫——豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)寄生于家兔等啮齿类动物所引起的一种寄生虫病,该病威胁养兔业发展和兔肉食品安全。为了鉴定TPO18抗原在豆状囊尾蚴和豆状带绦虫的分布,并建立兔豆状囊尾蚴病抗体间接ELISA检测方法,本研究原核表达兔豆状囊尾蚴18 kDa抗原,经蛋白纯化获得了可溶性的TPO18蛋白。TPO18蛋白免疫家兔制备了效价达1∶51200多克隆抗体。蛋白免疫印迹鉴定多克隆抗体与兔豆状囊尾蚴总蛋白、豆状带绦虫总蛋白及重组蛋白TPO18的反应原性,免疫组织化学法鉴定兔豆状囊尾蚴和豆状带绦虫虫体TPO18抗原分布,多克隆抗体与兔豆状囊尾蚴总蛋白、豆状带绦虫总蛋白及重组蛋白TPO18具有良好的反应原性,兔豆状囊尾蚴TPO18抗原主要分布于生发层和绒毛层,豆状带绦虫TPO18抗原主要分布在吸盘及吸盘周围和集合管上层细胞及绒毛层。以TPO18重组抗原包被酶标板,优化确定间接ELISA各项技术参数,建立基于TPO18抗原的间接ELISA抗体检测方法。经优化后的ELISA检测方法的检测条件为血清稀释度1∶100,抗原包被质量浓度为5 mg/L,抗原包被条件37℃1 h+4℃过夜,封闭条件1%BSA 37℃封闭60 min,血清反应时间60 min,酶标二抗稀释度1∶1000,酶标二抗作用时间60 min,底物反应时间15 min,临界值0.295。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明,该方法灵敏度较高,特异性较好,不与兔瘟、兔肝片吸虫、兔球虫、兔弓形虫等的阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于7%,重复性良好。运用该ELISA方法与剖检检测试验分别对86份临床血清样品检测,两种方法检测结果符合率为97.7%。综上所述,本研究成功建立了兔感染豆状囊尾蚴抗体的间接ELISA方法,为兔感染豆状囊尾蚴后感染情况监测提供了新的监测方法。; 王泽祥罗永禄薛萍车亮王由森苟惠天孙晓林; 关键词：酶联免疫吸附试验特异性敏感性

豆状囊尾蚴小胞外囊泡可抑制家兔外周血淋巴细胞NLRP3活化: 2024年; 本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔,分离不同感染时期的外周血淋巴细胞(PBLC),检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时,收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物(ESP),并通过超速离心分离小胞外囊泡,用ESP和小胞外囊泡分别处理PBLC,24小时后,利用qPCR和Western-blot分析炎症小体相关基因的表达变化。结果显示,家兔感染后第30天和60天,炎症小体相关基因NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显升高,而在感染第90天时明显下降;用ESP处理PBLC后,NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平也明显升高;而用小胞外囊泡处理细胞后,虽然IL-1β的表达水平升高,但NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显受到了抑制。说明豆状囊尾蚴可通过其ESP或小胞外囊泡调控家兔PBLC炎症小体的活化,从而达到其长期生存和持续感染的目的。; 蒲桂婷王立群刘婷丽王得先曹珊菱郭小腊殷宏骆学农; 关键词：豆状囊尾蚴

兔豆状囊尾蚴CPI Stefin免疫调节功能研究: 车亮

兔豆状囊尾蚴Ⅰ型胱抑素对脂多糖诱导小鼠脓毒症防治机制的研究: 2024年; 为深入探究兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)超家族成员I型胱抑素(Stefin)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒症的治疗效果,本研究将重组菌pGEX-4T-CpStefin/BL21经IPTG诱导表达重组Stefin蛋白(r-Stefin),采用GST试剂盒纯化上述蛋白,并去除内毒素后,采用SDS-PAGE检测r-Stefin的纯化效果。结果显示,r-Stefin在大肠杆菌中获得了表达且纯化效果较好。将雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组16只,分别为A组(生理盐水100μL/只,阴性对照组)、B组:GST蛋白对照组(25μg/只)、C组:r-Stefin组(25μg/只)、D组:脓毒症组(0.2 mg/100μL LPS/只)、E组:GST蛋白干预组(0.2 mg/100μL/只LPS+GST蛋白25μg/只)、F组:r-Stefin干预组(0.2 mg/100μL LPS/只+r-Stefin 25μg/只)。经腹腔注射后观察各组小鼠的临床症状、绘制各组小鼠在LPS诱导后不同时间的生存率曲线。在LPS诱导后12 h和24 h对各组小鼠采血,采用ELISA检测各组小鼠血清中各炎性细胞因子的含量,通过全自动生化仪测定各组小鼠血清中肝、肾功能指标。结果显示,D、E组小鼠经LPS诱导后很快出现被毛发凌乱、活动量减少、精神沉郁等症状。F组小鼠上述症状在一定程度上得到改善。A、B、C组小鼠均健活。生存率曲线显示,D组小鼠在36 h内全部死亡,E组小鼠在48 h~60 h时的生存率由75%快速降至72 h时的37.5%,F组小鼠的生存率在72 h时达75%。A~C组小鼠生存率均达100%。ELISA结果显示,LPS诱导12 h时,D组、E组和F组小鼠血清中促炎细胞因子(IL-6、TNF-α和TNF-β)及抑炎细胞因子(IL-10)的含量与A组相比均极显著升高;D组小鼠血清中IL-10含量显著低于F组。TNF-α及TNF-β含量分别极显著和显著高于F组。LPS诱导24 h时,D组小鼠血清中IL-6、TNF-α和TNF-β含量极显著高于F组,IL-10含量极显著低于F组。经LPS诱导后12 h,D组、E组、F组小鼠血清中肝脏指标ALB的含量与A组相比均极显著下降(P<0.001),ALT含量均极显著升高。D; 车亮王由森石正发李甲羊倩倩肖琴孙晓林; 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂小鼠脓毒症脂多糖

一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物及应用: 本发明公开了一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物，所述miRNA标志物为novel‑miR‑1，其序列为GCAGGUGCGAAAGCAGGUA。所述miRNA标志物，来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调...; 骆学农陈国梁刘婷丽李艳萍白雪王立群刘晓雷郭小腊

基于novel⁃miR1检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增方法的建立和应用被引量：1: 2023年; 目的建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法。方法以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel⁃miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel⁃miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只经口感染1000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果。结果电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2∶1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P<0.01)。ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95%,AUC为0.9550,似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性。结论建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3�; 陈国梁王立群李艳萍刘婷丽李红张少华骆学农强文军; 关键词：豆状囊尾蚴病滚环扩增

兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备被引量：1: 2023年; 【目的】旨在克隆兔豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)Stefin基因(CpStefin),原核表达并纯化兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,制备多克隆抗体并测定其效价。【方法】根据GenBank登录的猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列设计引物,以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板,运用RT-PCR方法克隆兔豆状囊尾蚴Stefin基因,构建克隆载体pMD-19TCpStefin,分析Cpstefin蛋白氨基酸序列的二级结构、理化性质、结构域,并分析其与其它绦虫Stefin基因的亲缘关系,构建系统进化树。以克隆载体pMD-19T-CpStefin为模板扩增兔豆状囊尾蚴Stefin基因,回收纯化的扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin,双酶切、测序结果与预期结果一致。重组质粒pGEX-4T-CpStefin转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达获得重组蛋白。应用亲和层析法纯化可溶性CpStefin重组蛋白,进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,运用ELISA方法测定其效价。【结果】首次克隆兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,基因大小约为290 bp,成功构建克隆载体pMD-19T-CpStefin;菌液PCR和双酶切鉴定结果表明重组质粒pGEX-4T-CpStefin构建正确,通过IPTG诱导表达获得分子质量大小约为35 kU的可溶性融合蛋白,亲和层析法纯化获得纯度较高的CpStefin重组蛋白,制备出的多克隆抗体效价达到1∶25600。【结论】本研究首次克隆出豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,运用原核表达系统可溶性表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,纯化获得纯度较高的豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin重组蛋白,制备的多克隆抗体效价达到1∶25600。; 王泽祥张国强王由森罗永禄薛萍白玉婷柳春霞; 关键词：豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂原核表达纯化多克隆抗体

豆状囊尾蚴外泌体let--7--5p调节宿主外周血Treg细胞分化的机制及诊断靶标研究: 豆状囊尾蚴病呈全球性分布，给养兔业造成了很大经济损失。研究报道,豆状囊尾蚴外泌体可诱导巨噬细胞向M2表型极化，与绦虫蚴引起的免疫抑制有关。而且小RNA测序发现，豆状囊尾蚴外泌体富含let-7-5p。那么，豆状囊尾蚴外泌体...; 王立群; 关键词：豆状囊尾蚴病外泌体 TREG细胞细胞分化

豆状囊尾蚴体外培养方法的建立及其分泌产物的分离鉴定被引量：1: 2022年; 目的建立豆状囊尾蚴体外长期培养方法,并对其培养分泌产物进行鉴定。方法将豆状带绦虫虫卵经口感染新西兰白兔(2000枚/只),感染后3个月,从感染兔腹腔中收集豆状囊尾蚴。将虫体随机分为PBS组、RPMI 1640组、胆汁组(RPMI 1640+10%兔胆汁)和血清组(RPMI 1640+10%无外泌体胎牛血清),10个/组,37℃、5%CO_(2)培养后5 min、1 h、2 h、12 h、24 h、36 h、48 h及其后每天进行观察,记录豆状囊尾蚴头节翻出情况、虫体活力、体外存活时间及形态改变等,筛选适宜的培养条件。取50个幼虫在细胞瓶(25 cm^(2))中按筛选出的培养条件培养,每隔48小时收集培养液离心浓缩,取上清,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测豆状带绦虫烯醇化酶(Tpeno)和Tp14-3-3蛋白的表达情况。收集豆状囊尾蚴培养上清,提取外泌体,分别与阴性兔血清、CD63抗体、抗Tpeno单克隆抗体1D7和抗Tp14-3-3多克隆抗体孵育45 min,再加入胶体金标记的IgG,透射电镜观察外泌体形态,免疫电镜检测其标记蛋白CD63、Tpeno和Tp14-3-3表达情况。采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,组间比较采用单因素方差分析。结果培养前的豆状囊尾蚴呈椭圆形,有内凹的点状乳白色头节;PBS组可存活7 d;RPMI 1640组可存活2个月;胆汁组存活时间最短,仅48 h;血清组幼虫存活时间最长,可达3个月以上,高于其他3个组(P<0.05)。存活期内,PBS组、RPMI 1640组、胆汁组和血清组幼虫囊泡长度分别为(1.38±0.39)、(1.30±0.12)、(1.18±0.59)和(1.83±0.10)cm;宽度分别为(0.45±0.10)、(0.68±0.05)、(0.25±0.06)和(0.85±0.05)cm;血清组虫体囊泡长度和宽度与其余3组相比差异均有统计学意义(F_(长度)=7.58、65.93、7.11,F_(宽度)=73.85、29.41、308.57,P<0.05或P<0.01)。培养12 h时,PBS组、RPMI 1640组、胆汁组和血清组幼虫头节翻出率分别为(33.3±5.8)%、(20.0±0.0)%、(100.0±0.0)%、(13.3±5.8)%,其中血清组与PBS和胆汁组头节翻出率差; 张少华刘婷丽骆学农王帅郭爱疆白雪陈国梁才学鹏; 关键词：豆状囊尾蚴体外培养免疫电镜

一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物及应用: 本发明公开了一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物，所述miRNA标志物为novel‑miR‑1，其序列为GCAGGUGCGAAAGCAGGUA。所述miRNA标志物，来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调...; 骆学农陈国梁刘婷丽李艳萍白雪王立群刘晓雷郭小腊; 文献传递

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