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原核Argonaute的应用研究进展: 2024年; 原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。; 王飞李文强刘洋王珑瑜陈晚苹崔佳凯马立新; 关键词：分子诊断

木薯过氧化氢酶基因的克隆与原核表达: 2024年; 活性氧(reactive oxygen species, ROS)的动态变化在植物的胁迫应答中起到非常重要的作用。过氧化氢酶(catalase, CAT)是动植物体内维持ROS稳态平衡的关键酶之一。为了更好地研究MeCAT1的基因特性及其在木薯响应外界环境变化的作用,本研究鉴定并克隆了木薯MeCAT1基因,成功构建MeCAT1的原核表达载体。通过蛋白结构域分析发现,MeCAT1具有过氧化氢酶的保守蛋白结构域。此后经由蛋白诱导及酶活测定试验表明MeCAT1重组蛋白具有显著的CAT酶活性。本研究为进一步探究MeCAT1在木薯应对生物胁迫和非生物胁迫过程中的作用提供了一定的分子依据,有利于MeCAT1基因在木薯育种中功能的深度挖掘和创新利用。; 董亚彬白玉晶; 关键词：过氧化氢酶原核表达

鸡白细胞介素-2原核表达及其活性鉴定: 2024年; 试验旨在获得具有生物活性的鸡白细胞介素-2(ChIL-2)重组蛋白。试验以克隆获得的ChIL-2基因为模板,分别构建原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)和BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2),进行诱导表达和纯化;通过BrdU ELISA法检测重组蛋白诱导鸡脾脏淋巴细胞的增殖情况,评估其生物活性;以rHis-ChIL-2免疫小鼠制备多克隆抗体。结果显示:成功构建了原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)、BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2);经表达纯化后分别获得纯度较高的rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白,大小分别为14 ku和39.4 ku;rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白分别能够促进脾脏淋巴细胞显著或极显著增殖(P<0.01或P<0.001),均具有良好的生物活性;以纯化的rHis-ChIL-2免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为5.12×105,可识别rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2,与真核表达的ChIL-2蛋白反应。结果表明,原核表达的重组蛋白ChIL-2具有良好的生物活性,采用其制备的多克隆抗体可识别真核表达的ChIL-2蛋白,为后期ChIL-2的检测奠定基础。; 韩顺子黄霞孟闯耿士忠耿士忠潘志明康喜龙; 关键词：原核表达生物活性多克隆抗体

黄土-古土壤原核生物群落对古气候变化的响应: 2024年; 【目的】黄土-古土壤序列是记录第四纪气候环境变化的良好载体,其内部的土壤微生物特征是蕴含土壤环境变化的重要信息。由于黄土与古土壤成壤环境的气候差异,微生物群落结构特征可能会有不同的响应,但针对该问题的研究还十分有限。【方法】选择任家坡(R)和九州台(J)两地黄土(RL和JL)-古土壤(RS和JS)序列,运用高通量测序技术和线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)识别土壤原核生物群落结构和类群差异,基于原核生物分类单元功能注释(functional annotation of prokaryotic taxa,FAPROTAX)数据库进行群落功能预测,以及利用Mantel test探讨影响土壤原核生物群落稳定的环境因子。【结果】土壤中碳氮营养物质与气候变化的代用指标磁化率、Rb/Sr变化趋势一致,含量整体表现为古土壤(RS和JS)高,对应的黄土(RL和JL)低,这一特征在任家坡古土壤(RS)中尤为显著;在同一气候时期,九州台较任家坡更为干冷,并且九州台古土壤沉积阶段也受到较强冬季风的影响,使其气候冷干与暖湿转变呈渐变型。原核生物群落结构中酸杆菌门(Acidobacteria)、泉古菌门(Crenarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)等具有嗜热嗜温性质的细菌和古菌在任家坡黄土-古土壤(RL和RS)中丰度较高,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)等耐旱、适宜极端环境中生存的细菌和古菌在九州台黄土-古土壤中(JL和JS)丰度较高。同时,生命产能、氮、锰、铁、氯元素循环相关功能基因在任家坡古土壤(RS)中表达量最高,而碳、氢、硫元素循环相关功能基因在任家坡黄土(RL)中表达量最高。与任家坡相比,九州台原核生物群落具有物种多样性高、功能种类少的特点。Mantel test分析进一步表明,有机碳(soil organic carbon,SOC; 刘秀花孙钰涵卢杰刘小康马延东贺屹贺屹; 关键词：黄土-古土壤序列古气候

不同药用植物根际土壤原核微生物多样性研究: 2024年; 为研究不同药用植物根际土壤中的原核微生物多样性,分别采集白术(Atractylodes macrocephala)、白芍(Paeonia sterniana)、牡丹(Paeonia suffruticosa)、玄参(Scrophularia ningpoensis)四种药用植物的根际土壤以及非种植区的土壤,针对16S rRNA基因的V3~V4区进行测序,分析土壤细菌群落的组成。结果表明,药用植物根际土壤中的细菌群落多样性指数显著高于非种植区土壤。五组样本的优势类群差异不大,总体相对丰度较高的有变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)等,药用植物根际中的放线菌相对丰度高于非种植区。属水平上四种药用植物根际细菌和非种植区的群落结构有较大差异,四种中药材的根际土壤中各自富集了特异性的有益细菌属。药用植物根际土壤中的NMD1、Dongia、Gaiella、Streptomyces等相对丰度高于非种植区,而非种植区土壤中Lysobacter相对丰度显著高于药用植物。此外,四种中药材的根际土壤中硝酸盐还原和芳香族化合物降解功能被富集。; 李运涛孟忠祥董晋苏佳铭李欢吕超田; 关键词：药用植物微生物多样性高通量测序根际土壤原核微生物

棉花GhMYB42基因的克隆及原核表达被引量：1: 2024年; MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析,通过Gataway BP和LR反应,将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhMYB42(XP_016732693.1)全长序列1508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸,预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现,MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域,是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示,陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP_012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显,因此,选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明,重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白,后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。; 李晨宇足木热木·吐尔逊李晓荣杨洋李波于月华; 关键词：陆地棉克隆原核表达

Filamentation and inhibition of prokaryotic CTP synthase with ligands: 2024年; Cytidine triphosphate synthase(CTPS)plays a pivotal role in the de novo synthesis of cytidine triphosphate(CTP),a fundamental building block for RNA and DNA that is essential for life.CTPS is capable of directly binding to all four nucleotide triphosphates:adenine triphosphate,uridine triphosphate,CTP,and guanidine triphosphate.Furthermore,CTPS can form cytoophidia in vivo and metabolic filaments in vitro,undergoing regulation at multiple levels.CTPS is considered a potential therapeutic target for combating invasions or infections by viral or prokaryotic pathogens.Utilizing cryo-electron microscopy,we determined the structure of Escherichia coli CTPS(ecCTPS)filament in complex with CTP,nicotinamide adenine dinucleotide(NADH),and the covalent inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine(DON),achieving a resolution of 2.9A.We constructed a phylogenetic tree based on differences in filament-forming interfaces and designed a variant to validate our hypothesis,providing an evolutionary perspective on CTPS filament formation.Our computational analysis revealed a solvent-accessible ammonia tunnel upon DON binding.Through comparative structural analysis,we discern a distinct mode of CTP binding of ecCTPS that differs from eukaryotic counterparts.Combining biochemical assays and structural analysis,we determined and validated the synergistic inhibitory effects of CTP with NADH or adenine on CTPS.Our results expand our comprehension of the diverse regulatory aspects of CTPS and lay a foundation for the design of specific inhibitors targeting prokaryotic CTPS.; Chenjun GuoZixuan WangJi‐Long Liu

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究: 2024年; [目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。; 梁之瑄梅晨张雪徐浩钧支岩李焕荣李焕荣; 关键词：副鸡禽杆菌原核表达免疫原性

犬弓首蛔虫超氧化物歧化酶的分子特性及原核表达: 2024年; 为探究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的分子特性,根据GenBank中登录的Tc-sod基因序列(GenBank:AAB00227.1),以T.canisc DNA为模板对Tc-sod全长基因进行扩增,并进行序列分析和多重序列比对;同时构建Tc-sod/pET-32a原核表达载体,经ITPG诱导表达,对重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体.结果显示Tc-sod全长基因为573 bp,共编码190个氨基酸;多重序列分析表明Tc-SOD的氨基酸序列与曼氏血吸虫、异尖线虫、美洲板口线虫、马来丝虫、犬钩口线虫均具有SOD-Cu保守结构域.种系发育分析发现Tc-SOD与马来丝虫进化关系较近. SDS-PAGE结果显示重组蛋白Tc-SOD的大小约为37 ku,以可溶性形式表达;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,以70 mmol/L咪唑进行洗脱时可获得高纯度的目的蛋白;将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测显示抗体滴度>1∶320 000,表明重组蛋白的免疫原性较好;Western Blot结果显示抗体能与Tc-SOD蛋白特异性结合,表明抗体特异性高.; 吴天乐王磊王冰楠孙雪杨晓伟周荣琼; 关键词：超氧化物歧化酶分子特性原核表达多克隆抗体

马铃薯液泡蔗糖转化酶原核表达及多克隆抗血清的制备被引量：1: 2024年; 马铃薯液泡蔗糖转化酶在马铃薯块茎低温糖化过程中起着关键作用。将马铃薯液泡蔗糖转化酶基因StVIN1的N端部分片段连接到原核表达载体pET-28a,将重组质粒pET-28a-StVIN1-N通过热激的方法转化到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,经0.84 mmol/L IPTG诱导得到带有6×His标签的融合蛋白。以纯化后的蛋白为抗原免疫家兔,获得多克隆抗血清。利用得到的抗血清对纯化后的蛋白进行Western blot鉴定,结果表明所制备的多克隆抗血清具有良好的特异性。; 巩慧玲吕鹏刘金宝梁金永; 关键词：马铃薯原核表达

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