苏州市科技计划项目(SYS201104)
- 作品数：7 被引量：12H指数：3
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- 抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性
- 2012年
- 目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应。方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL。SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆。IMAC纯化并定量抗体。免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响。结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株。培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L。抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2%及70.6%。经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37%。结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应。
- 王志强安萌朱华亭孔永王婧韩莲花夏永洁邱玉华
- 关键词：CHO细胞双价抗体抑制增殖
- D-半乳糖致衰老小鼠胸腺T细胞重要膜型分子的改变及其意义被引量：4
- 2012年
- 目的:建立D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型,并探讨其胸腺T细胞重要膜型分子的改变及其意义。方法:8周龄雌性昆明种小鼠,12.5 mL/(kg.d)颈后部皮下注射100 g/LD-半乳糖溶液,连续注射42 d;逐日观察小鼠的生存状态和行为变化,并通过对小鼠血清中SOD活力和MDA含量的检测,对此衰老模型进行生物学鉴定;在D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型成功建立的基础上,采用免疫荧光标记技术和流式细胞仪检测技术对胸腺T细胞重要膜型分子进行检测分析。结果:造模过程中小鼠逐渐表现出脊椎隆起,体形消瘦,皮肤松弛等衰老体征;血清中SOD活力下降[模型组:(2.16±0.43)mKat/L,对照组:(5.52±1.55)mKat/L,P<0.01],MDA含量上升[模型组:(4.14±0.82)μmol/L,对照组:(1.24±0.21)μmol/L,P<0.01];小鼠胸腺初始T细胞相关分子CD45RA表达下降[模型组:(2.16±0.47)%,对照组:(2.98±0.53)%,P<0.05];小鼠胸腺T细胞活化相关分子CD28[模型组:(91.52±1.68)%,对照组:(95.12±1.21)%,P<0.05]和CD25[模型组:(7.42±0.75)%,对照组:(8.84±0.58)%,P<0.05]表达下降;小鼠胸腺T细胞活化负性调控分子PD-1表达上升[模型组:(21.25±1.95)%,对照组:(12.92±3.28)%,P<0.01];小鼠胸腺记忆T细胞相关分子CD196表达上升,但与对照组相比没有显著性差异[模型组:(21.13±1.44)%,对照组:(19.73±2.02)%]。结论:成功建立了D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型,机体衰老时胸腺中初始和活化T细胞减少,记忆T细胞有增加的趋势。
- 张彦军朱华亭黄赛男薛秀青邱玉华
- 关键词：D-半乳糖亚急性衰老免疫活化免疫记忆
- D-半乳糖致衰老小鼠模型脾脏B细胞的改变被引量：4
- 2012年
- 目的:运用D-半乳糖建立亚急性衰老小鼠模型,在对其进行生物学鉴定的基础上,分析脾脏B细胞表面重要膜型分子的改变及其意义。方法:健康昆明鼠,颈后部皮下注射100 g/L D-半乳糖溶液,0.25 mL/20 g,1次/d,连续42 d。逐日观察动物的生存状态和生物学行为并定期称量其体质量动态变化。小鼠衰老模型的生物学鉴定采用血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度的测定;脾脏细胞表面与活化、记忆相关的重要膜型分子的分析采用免疫荧光和流式细胞术;血清中细胞因子IL-4的分析采用ELISA法。结果:成功建立亚急性衰老小鼠模型。免疫荧光和流式细胞术分析模型组小鼠脾脏细胞上CD20+为56.8%,CD40+为43.6%,CD20+CD45RA+B为14.04%,CD40+CD45RA+B为35.4%,CD20+CD86+B为2.25%。CD40+CD86+B为4.38%,CD20+CD196+B为10.68%,CD40+CD196+B为10.98%。ELISA法检测结果显示模型组小鼠血清中IL-4的平均水平为7.93 ng/L。经统计学分析模型组小鼠脾脏细胞CD20、CD40、CD45RA、CD86的表达及血清中IL-4的水平均低于对照组(P<0.05),CD196高于对照组(P<0.01)。结论:在机体衰老过程中,脾脏B细胞表面与活化、记忆相关的重要膜型分子的表达发生改变,活化细胞减少,记忆细胞增多,血清中IL-4的表达下降,导致免疫系统功能紊乱。
- 黄赛男朱华亭张彦军薛秀青邱玉华
- 关键词：D-半乳糖衰老脾脏细胞
- 抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析被引量：2
- 2013年
- 目的构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能。方法从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞。经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化。流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应。MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响。结果获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体。CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0%、72.3%和80.5%。CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3%。结论成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV)。该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性。
- 安萌王志强朱华亭孔永王婧沈立军韩莲花夏永洁邱玉华
- 关键词：CD86单链抗体真核表达
- D-半乳糖致衰老小鼠脾脏T细胞亚群的改变及其意义被引量：3
- 2012年
- 目的:探讨D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠脾脏T细胞亚群的改变及其意义。方法:运用100 g/L D-半乳糖溶液建立小鼠亚急性衰老模型,并对此衰老模型进行生物学鉴定。ELISA检测模型小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量;流式细胞术检测模型小鼠脾脏中初始、活化及调节性T细胞相关分子的改变。结果:模型组小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量分别为(82.93±2.74)pg/mL和(125.41±3.16)pg/mL,与对照组[(125.41±3.16)pg/mL和(8.28±2.47)pg/mL]相比含量降低(P<0.01)。脾脏中初始T细胞相关分子CD45RA表达下降[模型组:(4.46±1.21)%,对照组:(7.38±1.03)%,P<0.01];活化T细胞相关分子CD25表达下降[模型组:(6.74±0.81)%,对照组:(5.14±1.25)%,P<0.05];Foxp3在CD4+CD25+T细胞中表达上升[模型组:(18.32±1.44)%,对照组:(10.14±1.52)%,P<0.05]。结论:机体衰老时脾脏中初始和活化T细胞减少,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tr)增多,T细胞活化及免疫调节能力下降。
- 张彦军朱华亭黄赛男夏永洁王志强沈立军安萌邱玉华
- 关键词：D-半乳糖亚急性衰老脾脏T细胞亚群
- 抗人CD80单链抗体对不同肿瘤细胞膜型CD80分子的识别与体外增殖的影响被引量：2
- 2012年
- 目的:制备真核细胞CHO表达的CD80单链抗体(CD80-scFv)并研究其对不同肿瘤细胞膜型分子的识别及增殖的影响。方法:将表达CD80-scFv的CHO细胞大规模无血清培养收集上清,采用IMAC亲和层析法纯化获取抗人抗体。采用免疫荧光及流式细胞术分析其对人恶性B系淋巴瘤细胞株Daudi、人黑色素瘤细胞株A375、神经胶质瘤细胞株U251及人多发性骨髓瘤细胞株8266及U266细胞膜型CD80分子的识别。在上述肿瘤细胞的培养体系中加入不同浓度的CD80-scFv,MTT法分析其对肿瘤细胞增殖的影响。以天然高表达CD80分子的8266细胞经丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC作为效应细胞,分析抗体通过阻断共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:从CHO细胞培养上清中获取的抗人CD80-scFv纯化品的量为6.67 mg/L;该抗体与Daudi、U251、A375、8266及U266的阳性结合率分别为96.8%、39.6%、20.5%、99.9%及3.8%。抗体对高表达CD80分子的Daudi及8266细胞具有增殖抑制作用,加入抗体(终浓度为25μg/mL)培养72 h时的抑制率分别为24.04%及24.16%。同时,抗体通过阻断CD80-CD28介导的共刺激信号,抑制PBMC的增殖。结论:CD80-scFv能够特异识别细胞膜型CD80分子,并对高表达细胞的体外增殖具有抑制作用。
- 沈立军韩莲花朱华亭孔永安萌王婧夏永洁邱玉华
- 关键词：CD80单链抗体CHO增殖阻断
- D-半乳糖所致衰老小鼠抗原提呈细胞的改变及其意义
- 2012年
- 目的:研究D-半乳糖所致衰老小鼠专职性抗原提呈细胞的改变及其意义。方法:取健康昆明雌性小鼠,2月龄,运用D-半乳糖建立衰老小鼠模型并进行生物学鉴定后,采用免疫荧光和流式细胞术测定脾脏中巨噬细胞CD11b、树突状细胞CD11c、B淋巴细胞CD40的表达;采用免疫组化法测定脾脏组织Fas表达的改变。结果:模型组小鼠巨噬细胞CD11b+/MHC-Ⅱ+CD11b+的百分率为9.78±1.42,与对照组10.76±1.93相比下降(P<0.05);模型组小鼠树突状细胞CD11c+/MHC-Ⅱ+CD11c+、B淋巴细胞CD40+的百分率分别为5.34±0.74、43.60±8.06,与对照组7.88±1.73、56.70±10.97相比明显下降(P<0.01)。模型组小鼠脾脏组织Fas表达增加。结论:D-半乳糖所致衰老小鼠脾脏各种专职性抗原提呈细胞减少,脾脏组织Fas的表达出现渐进性增加。
- 黄赛男朱华亭张彦军夏永洁沈立军王志强安萌孔永邱玉华
- 关键词：D-半乳糖衰老抗原提呈细胞FAS
