国家自然科学基金(30970563)
- 作品数：4 被引量：5H指数：1
- 相关作者：汪德强赵沙沙杨伟金丽周华更多>>
- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属第一医院重庆医科大学附属第二医院更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人α1微球蛋白质的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:构建人α1微球蛋白质(α1-microglobulin,α1M)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达α1M蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:PCR扩增α1M基因序列,然后转化入大肠杆菌B834中进行表达,利用镍离子亲和层析、离子交换层析及分子筛纯化,ABTS法鉴定其生物学活性。结果:正确构建了α1M的表达质粒,α1M在大肠杆菌B834中为可溶性上清表达,纯化获得了纯度高达95%的α1M蛋白质,分子筛结果显示其在溶液中呈现单体和二聚体2种聚集状态,ABTS法结果显示了重组获得的α1M具有抗氧化活性。结论:α1M能在大肠杆菌B834菌中大量上清表达,且易于纯化,初步鉴定具有抗氧化活性,为下一步进行α1M蛋白质的晶体结构解析和相关功能研究奠定了基础。
- 张阳丽汪德强
- 关键词：纯化活性鉴定
- 重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析
- 2012年
- 甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点.本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白.再用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化.经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在.光谱实验证实,该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1,3-二羟基丙酮的活性.用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine pH 9.6,13%PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4%Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.
- 赵沙沙牛司强金丽杨伟汪德强
- 关键词：肺炎链球菌甘油脱氢酶蛋白表达纯化
- 一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定
- 2012年
- 【目的】核黄素(vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要。如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素(flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖。3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一。在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一。人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点。本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础。【方法】利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs。将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定。【结果】酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95%的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在。对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性。【结论】第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础。
- 金丽周华赵沙沙杨伟牛司强汪德强
- 稀有密码子对人源Id2基因表达的影响被引量：4
- 2013年
- 目的:通过对人Id2基因的稀有密码子进行突变并构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)中表达Id2蛋白,分析稀有密码子对Id2基因表达的影响。方法:PCR扩增突变Id2基因序列,然后转入E.coli BL21中进行表达,利用镍离子亲和层析、离子交换层析及分子筛纯化。结果:正确构建了Id2基因的基因突变表达质粒,基因突变表达的Id2蛋白在E.coli BL21中为可溶性上清表达,成功纯化了目的蛋白,且分子筛结果显示其在溶液中呈现二聚体状态。结论:稀有密码子对Id2蛋白在E.coli BL21中大量可溶性上清表达有重要影响。
- 杨伟周华赵沙沙金丽郭珍张绍城陈检汪德强
- 关键词：ID2突变纯化
