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沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备被引量：1: 2010年; 目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。; 郭晓雅师长宏邵成赵勇史皆然; 关键词：沙门菌原核表达多克隆抗体

屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌的构建及其鉴定被引量：1: 2012年; 目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原(Der p2)的基因重组耻垢分枝杆菌(rM.s)。方法采用电穿技术,将鉴定好的PCW-Der p2质粒转化到耻垢分枝杆菌(M.s),通过PCR鉴定目标基因在rM.s中的表达。结果经PCR鉴定,成功将PCW-Der p2质粒转化到M.s。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Der p2-rM.s。; 侯美娜郭晓雅史皆然; 关键词：耻垢分枝杆菌

沙门菌Omp D介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定: 2012年; 目的利用重组BCG（rBCG）技术，构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Derp2和OmpD抗原的两种rBCGLI服疫苗。方法经PCR法分别扩增获得Derp2和OmpD基因，测序正确后将两者克隆人原核表达载体pProEXHTb，获得pProEXHTb-De．rp2-OmpD质粒。①串联表达：将Derp2-OmpD融合基因亚克隆人穿梭胞壁表达载体pCW，经酶切鉴定阳性命名为pCW-Derp2-OmpD质粒。将此重组质粒电穿导人BCG感受态细胞，构建可胞壁串噘表达Derp2-OmpD融合蛋白的rBCG；②并联表达：构建pCW-Derp2与pCW-OmpD两种质粒，井将二者同时电穿导人BCG感受态细胞，以构建胞壁并联表达Derp2和OmpD蛋白的rBCG。经潮霉素抗性筛选的阳性克隆，均采用以下三种方式进行鉴定：PCR特异性扩增目的基因片段；用兔抗Derp2多克隆抗体与兔抗OmpD多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定。结果采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Derp2和OmpD蛋白的两种rBCG口服疫苗，并通过PCR、斑点免疫杂交法及间接免疫荧光法分别进行鉴定。结论两种rBCG口服疫苗构建成功，为体外实验和临床应用提供基础。; 郭晓雅邵成胡琳洁侯美娜史皆然; 关键词：OMP P2 重组BCG 口服疫苗

比较口服不同亲和力重组耻垢分支杆菌调节免疫的差异被引量：1: 2013年; 目的:Th1与Th2的平衡紊乱是过敏性哮喘的免疫学基础,本研究通过给予小鼠口服免疫不同亲和力屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌,来比较其调节免疫应答的差异。方法:1,分别给予6-8周BALB/c小鼠口服接种Mycobacterium Smegmatis(M.S)、pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S,在末次免疫后第14、28、56天分别用夹心ELISA法测定小鼠血清及脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2及IL-4的含量。结果:夹心ELISA结果显示,无论是血清还是脾脏淋巴细胞培养上清中,各组IFN-γ、IL-2水平逐渐升高,IL-4水平逐渐降低,8周时更明显,pCW-Der p2-PEB1-rM.S组与M.S、pCW-Der p2-rM.S组相比有明显统计学差异。体外给予Der p2蛋白刺激后,pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S组变化更加明显,而M.S组无明显变化。结论:小鼠口服免疫pCW-Der p2-PEB1-rM.S能明显提高Th1型免疫反应,与pCW-Der p2-rM.S组相比有统计学学差异。三种不同亲和力重组耻垢分枝杆菌经口服后均能诱导小鼠产生Th1型免疫应答,且pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S诱导产生的Th1优势应答具有Der p2抗原特异性。本研究弥补了粘膜型疫苗低亲和力的不足,为新型口服疫苗的制备和改进创造了条件。; 解婷薛莹樊爱琳简文; 关键词：耻垢分枝杆菌口服疫苗 TH1 TH2

评价空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1介导的重组BCG与上皮细胞的结合能力被引量：1: 2011年; 目的:评价PEB1介导的屋尘螨抗原(Derp2)重组BCG疫苗(PEB1-Derp2-rBCG)与人上皮细胞的结合能力。方法:采用体外细胞培养的方法,分别将普通BCG、胞壁型Derp2-rBCG和胞壁型融合蛋白PEB1-Derp2-rBCG与HeLa细胞及人类肠粘膜上皮细胞(HIEC)进行共孵育,利用HE和抗酸染色法对各组细胞与疫苗的黏附结果进行染色,光学显微镜下计数各组的黏附率,并进行比较;对以上各组分别加入PEB1蛋白,进行黏附阻断,观察对结合能力的影响。结果:孵育24小时后,无论HeLa细胞还是HIECPEB1-Derp2-rBCG组较普通BCG组和Derp2-rBCG组的黏附率明显提高,差异有显著性(P<0.05);PEB1蛋白的加入对PEB1-Derp2-rBCG的黏附功能有明显抑制作用(P<0.05);但是,Derp2-rBCG组与普通BCG组比较没有明显差异(P>0.05),PEB1蛋白的加入对二者的黏附亦无影响(P>0.05)。结论:PEB1具有介导增强PEB1-Derp2-rBCG与上皮细胞黏附的能力。; 胡琳洁郭晓雅侯美娜邵成史皆然; 关键词：重组BCG 细胞黏附

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国家自然科学基金(30871114)