教育部科学技术研究重点项目(105175)
- 作品数：1 被引量：4H指数：1
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- 抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达被引量：4
- 2007年
- 目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。
- 王宏陈丹邓宁向军俭靳英杰黄红亮唐勇杨红宇
- 关键词：BFGF单克隆抗体可变区基因单链抗体
