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慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群与病毒载量的相关性分析: 2007年; 目的:分析慢性丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群的变化以及与HCV病毒载量的相关性,探讨慢性HCV感染慢性化的免疫机理。方法:应用直接免疫荧光-流式细胞术检测47例慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞的相对数量,与35例正常健康人做比较;应用实时荧光定量RT-PCR对其外周血HCV病毒载量进行检测,将慢性HCV感染者分为两组进行比较分析。结果:外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4/CD8比值慢性丙型肝炎患者组低于正常人组(P<0.05),HCV RNA阳性组与HCV RNA阴性组之间的差异无统计学意义(P>0.05);NK细胞比例慢性丙型肝炎患者组高于正常人组(P<0.05),HCV RNA阴性组高于HCV RNA阳性组(P<0.05)。结论:慢性HCV感染者存在细胞免疫功能低下,NK细胞介导非特异性免疫的持续上调,在有效地清除了部分HCV病毒的同时,可能促进了持续性免疫性肝损伤。; 宋培新韩亚萍孔练花刘源李军; 关键词：慢性HCV感染淋巴细胞亚群病毒载量

乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞应答与不同临床感染状态的关系被引量：3: 2009年; 目的分析人类白细胞抗原（HLA）-A0201限制性的特异性CTL，研究急性肝炎急性期和慢性乙型肝炎活动期患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异。方法收集HLA—A0201阳性的5例急性肝炎急性期和6例慢性乙型肝炎活动期患者的外周血单个核细胞（PBMc），酶联免疫斑点技术（EI，ISPOT）测定针对HBV聚合酶区（P01575—583）、包膜区（Env348—357）和核心区（Core18—27）3个CD8^＋T淋巴细胞表位肽特异性CTL的数量和功能。数据采用t检验。结果经P01575583、Env348—357和Core18—27三条抗原肽刺激，急性乙型肝炎急性期患者组斑点形成细胞数（SFC）分别为110±13、165±17和185±20；慢性乙型肝炎活动期患者组SFC分别为22±4、23±5和30±5，两组差异有统计学意义（f值分别为10．9、15．2和8．0，均P〈0．05）。急性乙型肝炎急性期患者各抗原肽特异性CTL的应答能力P01575—583〈Env348—357〈Corel8-27，其中P01575—583和Core18-27比较，差异有统计学意义（t=4．0，P〈0．05），而Env348—357和Core18—27比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。非特异性HLA-2402限制性Corell7-125刺激也出现SFC增加，但与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论急性感染者HBV特异性CTL应答水平显著高于慢性HBV感染者，慢性乙型肝炎患者体内的多克隆CTL数量和功能低下。; 万玉峰韩亚萍李军孔练花李爽董莉陈念刘源黄祖瑚; 关键词：HLA抗原酶联免疫斑点技术

肝病患者的肝组织单细胞悬液与外周血中淋巴细胞亚群的分析比较被引量：7: 2005年; 目的探讨肝脏组织单细胞悬液的制备方法,了解慢性肝病患者的肝组织和外周血的淋巴细胞亚群差异。方法分别选择慢性乙型肝炎(CHB)14例、自身免疫性肝炎(AIH)4例和原发性肝细胞癌(HCC)3例,在超声引导下经皮作肝脏穿刺活检,用单细胞制备仪或物理研磨方法将肝组织制备成单细胞悬液,肝组织中淋巴细胞经4种特异性荧光抗体标记,在流式细胞仪(FCM)上作四色荧光分析,并与外周血测定结果比较。结果单细胞制备仪和物理研磨方法制备的肝组织单细胞悬液,细胞成活率分别为92.4%和91.5%;检测肝组织单细胞悬液中淋巴细胞亚群,正常对照组和慢性肝病各组间差异均有显著性(P<0.05),AIH组和CHB组间差异有显著性(P<0.05)。而外周血中淋巴细胞亚群检测,HCC组和CHB组间差异有显著性(P<0.05)。肝组织和外周血相应项目比较差异均有显著性(P<0.05)。结论用2种方法制备单细胞悬液能满足FCM检测的特殊需要;肝脏组织中淋巴细胞与外周血的淋巴细胞亚群比例差异有显著性。; 韩亚萍刘源李军陈念董莉蔡洁黄祖瑚; 关键词：淋巴细胞亚群单细胞悬液肝脏

慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测被引量：4: 2007年; 目的建立一种肝活检组织中 HBV 共价闭合环状 DNA(cccDNA)的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份,来源于江苏省人民医院肝脏手术患者,包括19份慢性 HBV 感染,其中 HBeAg(+)标本10份,HBeAg(-)标本9份,4份非 HBV 感染为阴性对照组,取 HBV DNA 阳性的患者外周血作为 rcDNA 组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶 K 和细胞裂解缓冲液消化后,用液相抽提法提取核酸,将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链 DNA 的核酸酶加以消化,纯化后使用跨缺口引物和 SYBR Green Ⅰ荧光染料进行实时荧光定量 PCR 分析;另1等份则用以-定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过 PCR 反应产物的序列分析及 rcDNA 组结果的对照进行证实,HBeAg(+)组和 HBeAg(-)组 cccDNA 水平的差异通过两样本 t 检验进行分析。结果 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350 bp左右,DNA 测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99%以上,且以 rcDNA 为对照的结果均为阴性,排除最有可能造成假阳性的 rcDNA 对结果的干扰。本方法对10 mg HBeAg(+)肝组织标本的cccDNA 的检测阳性率为100%。血清 HBeAg(+)的肝组织样本的平均 HBV cccDNA 水平高于HBeAb(+)的肝组织标本(P<0.05)。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用 SYBR Green Ⅰ荧光染料和β-Globin 作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量 PCR 方法检测肝细胞内 HBV cccDNA,具有较高的特异性、敏感性,且成本较低的特点。; 李军宋培新韩亚萍刘婷黄祖瑚; 关键词：乙型 DNA

骨髓间充质干细胞移植在急性肝损伤大鼠肝脏内定植能力的实验研究被引量：4: 2007年; 目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肝损伤大鼠肝脏内移植情况。方法:首先行大鼠骨髓间充质干细胞提取、分离和培养,传代扩增后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制备大鼠急性肝损伤模型,试验分三组(A、B、C组),经阴囊上静脉向肝损伤组(A组)及肝脏正常(C组)的大鼠移植标记BrdU的BMSCs 1～1.5×106,同时向肝损伤组(B组)的大鼠移植等量的生理盐水。2周后观察大鼠的存活率及肝功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏中BrdU+细胞数量及分布。结果:移植2周A组、B组动物存活率、肝功能恢复情况无明显差异,肝损伤组(A组)及肝脏正常组(C组)大鼠肝脏均可检测到BrdU+细胞分布,A组与C组相比,A组BrdU+细胞数较多,分布更广,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞可以在受损的肝脏及正常肝脏定植,定植的数量可能和肝脏是否受损伤相关。; 陈念俞悦李军章莉莉刘源韩亚萍; 关键词：骨髓间充质干细胞急性肝损伤细胞移植

慢性乙型肝炎患者单核细胞来源树突状细胞Toll样受体的表达特征分析被引量：2: 2007年; 目的观察慢性乙型肝炎(CHB)患者单核细胞来源树突状细胞(moDC)Toll样受体(TLR)的表达,并分析抗病毒相关TLR(TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9)在CHB患者moDC的表达特征及意义。方法用羟乙基淀粉(HES)分离10例CHB患者及15例健康对照外周血单个核细胞(PBMC),经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhlL-4)诱导培养树突状细胞(DC),经流式细胞仪用特异性单克隆抗体检测不同成熟阶段DC的TLR表达,并以HBcAg负载未成熟DC,应用FACS分析HBcAg的负载效率及细胞内IFN-γ、IL-4表达水平。结果moDC不同成熟阶段TLR的表达水平不同;CHB患者的未成熟moDC(imDC)表达的TLR7、TLR8低于健康对照(75.9%、1.0%比98.4%、15.4%,P<0.05),CHB患者成熟moDC(mDC)表达TLR3、TLR7低于健康对照(9.5%、79.7%比11.5%、90.7%,P<0.05);应用HBcAg分别于细胞培养第3天和第5天冲击DC,第1次冲击后48 h HBcAg的膜内、膜外负载率分别为53.0%和7.5%,第2次冲击后分别为80.2%和19.0%;HBcAg负载或未负载的moDC,均刺激淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达或不表达IL-4,呈现显著的Th1免疫应答。结论CHB患者moDe的抗病毒相关TLR表达低下,且可能是其DC功能低下的重要原因之一;应用HBcAg冲击imDC,可使其有效负载HBcAg,负载后DC的成熟过程及功能不受影响,仍以诱导Th1免疫应答反应为主。; 李军韩亚萍孔练花刘源陈念黄祖瑚; 关键词：受体细胞表面树突细胞肝炎乙型肝炎核心抗原乙型

慢性乙型肝炎患者单核细胞来源树突状细胞Toll样受体7的表达低下被引量：2: 2007年; 目的:观察慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者单核细胞来源树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells,moDC)的Toll样受体7(toll-like receptor7,TLR7)表达,并分析在CHB患者moDC的表达特征及意义。方法:用羟乙基淀粉(HES)分离CHB及健康人外周血单个核细胞(PBMC),经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养DC,经流式细胞仪(FACS)用特异性单克隆抗体检测不同成熟阶段DC的TLR7表达,以及自体淋巴细胞混合培养后细胞内IFN-γ、IL-4表达水平。结果:①moDC的不同成熟阶段TLR7的表达水平不同;②与对照组比较,CHB患者的moDC不同成熟阶段TLR7的表达显著低下(P<0.05);③moDC刺激自体淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达或不表达IL-4,呈现显著的Th1免疫应答。结论:CHB患者moDC的TLR7表达显著低下;moDC诱导自体淋巴细胞以Th1免疫应答反应为主。; 李军韩亚萍孔练花刘源陈念董莉黄祖瑚; 关键词：树突状细胞慢性乙型肝炎

乙型肝炎e抗原对外周血单核细胞Toll样受体2表达的影响被引量：11: 2008年; 目的探讨HBeAg对外周血单核细胞表面Toll样受体2（TLR2）表达的影响。方法对68例慢性乙型肝炎（CHB）患者（其中HBeAg与HBVDNA阳性37例，HBeAg阴性、HBVDNA阳性14例，HBeAg与HBVDNA阴性17例）和16名健康人的外周血肝素抗凝，加入Pam3CSK4在37℃、5％CO2条件下刺激3h，用特异性TLR2单克隆抗体标记，经流式细胞仪检测CD14＋’细胞表面TLR2表达的百分率；比较刺激前后各组之间的差异。定量检测HBVDNA和血清HBV标志物，分析TLR2表达水平与HBeAg、HBV DNA的关系。用HBeAg与健康人及HBeAg阴性CHB患者的抗凝血在37℃、5％CO2条件下共培养6h，用流式细胞仪定量分析HBeAg刺激后CD14＋细胞表面TLR2的表达水平。结果HBeAg阳性CHB患者外周血CD14＋细胞TLR2的表达率为47．57％±21．40％，明显低于健康对照组（76．51％±7．46％）和HBeAg阴性组（HBVDNA阳性组为73．2％±14．2％、HBVDNA阴性组为75．2％±11．3％，P〈0．05）；TLR2的表达水平在HBeAg阴性的HBVDNA阳性或阴性CHB患者组与健康对照组的差异无统计学意义。HBeAg阳性CHB患者外周血单核细胞经Pam3CSK4刺激后，TLR2的表达率明显升高，大部分患者TLR2的表达水平能够达到健康人或HBeAg阴性患者未经配体刺激的水平。健康人或HBeAg阴性CHB患者的外周血与HBeAg共孵育6h后，CD14＋细胞表面TLR2表达水平较HBeAg刺激前明显下降（P〈0．05）。结论HBeAg阳性的CHB患者外周血CD14＋细胞TLR2的表达水平明显低于HBeAg阴性患者和健康人，HBeAg能够抑制CD14＋细胞TLR2的表达，提示HBeAg能够引起CHB患者外周血单核细胞表面TLR2表达的下调，这可能是HBV持续感染的重要因素之一；CHB患者HBVDNA水平可能不影响单核细胞表面TLR2的表达；Pam3CSK4可以明显提高HBeAg阳性CHB患者单核细胞表面TLR2的表达水平，TLR2配体有可能成为CHB免疫治疗的一个潜在靶位。; 韩亚萍李军万玉峰孔练花蔡洁董莉刘源陈念黄祖瑚; 关键词：肝炎E抗原乙型单核细胞 TOLL样受体2 固有免疫

慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的树突状细胞Toll样受体4表达低下: 目的研究急性和慢性乙型肝炎病人单核细胞来源的树突状细胞(Monocyte origin dendric cells,moDC)的 Toll 样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)的表达, 探讨 ...; 万玉峰孔练花韩亚萍李军董莉刘源陈念黄祖瑚; 文献传递

外周血树突状细胞免疫治疗体外培养条件的优化被引量：11: 2005年; 韩亚萍李军刘源章莉莉黄祖瑚; 关键词：树突状细胞体外培养条件细胞免疫治疗外周血抗肿瘤免疫治疗抗病毒治疗抗原递呈细胞

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江苏省卫生厅医学科技发展基金(H200311)

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