国家自然科学基金(30970029)
- 作品数：12 被引量：45H指数：4
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- 相关领域：医药卫生生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定被引量：3
- 2012年
- 采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharose离子交换层析纯化获得较高纯度的目的产物,SDS-PAGE检测为单一条带。Western Blot分析结果显示,目的产物同时具有HSA和IL-2的抗原性,为HSA和IL-2的融合分子。经CTLL-2/MTT细胞增殖法测定,纯化的融合蛋白的生物学活性为1.147×107 IU/mg。
- 李波段作营张红梅雷楗勇陈蕴唐瑜菁金坚李华钟
- 关键词：人血清白蛋白融合蛋白纯化
- 人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制被引量：6
- 2012年
- 筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白。经摇瓶及5 L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件。经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L。离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化。纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测。筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件。纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95%,相对分子质量为85 821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符。内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求。体外生物细胞活性高达1.6×106IU/mg。具有良好的工业应用价值。
- 钱凯雷楗勇关波陈蕴饶志明金坚
- 关键词：毕赤酵母融合蛋白
- 人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的设计与活性验证
- 2012年
- 通过对NCBI数据库中不同物种同源序列进行比对protein-protein BLAST,并利用计算机软件DiscoveryStudio3.1进行分子对接和分子动力学模拟,对天然人甲状旁腺激素(1 34)的3个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27置换,并对突变体的生物活性进行了评价。结果显示:突变后PTH(1 34)-(RKK-QEL)和突变前PTH(1 34)多肽主链叠合后均方根偏差RMSD值为2.509 3,说明两者主链结构构象差异不大;PTH(1 34)-(RKK-QEL)与受体蛋白PTH1R的相互作用能为599.253 kcal.mol 1,较天然PTH(1 34)的554.083 kcal.mol 1增强7.5%;氢键数目由32对增加至38对;PTH(1 34)-(RKK-QEL)能显著刺激UAMS-32P细胞RANKL基因的表达(P<0.01),并抑制OPG基因的表达(P<0.01);PTH(1 34)-(RKK-QEL)作用于UAMS-32P和小鼠原代股骨骨髓细胞共培养体系时,能显著刺激破骨细胞的形成(P<0.01),并且活性高于PTH(1 34)标准品。
- 邱爽姜曰水李芝芹雷楗勇陈蕴金坚
- 关键词：突变蛋白成骨细胞破骨细胞骨保护素
- 改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展被引量：14
- 2011年
- 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于能高效表达正确折叠加工的外源蛋白而成为目前最具应用前景的表达宿主。但随着对大量不同外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究发现,并不是所有蛋白均能高效分泌表达,这严重限制了毕赤酵母这一表达系统的推广应用。相关研究发现,外源蛋白在内质网中的聚集是限制酵母分泌表达外源蛋白的主要因素,因此近年来开始尝试通过基因操作改良毕赤酵母表达外源蛋白的能力。本文综述了这一领域的研究进展。
- 关波金坚李华钟
- 关键词：巴斯德毕赤酵母外源蛋白分泌表达
- 免疫法筛选酵母HSA-IL-11融合蛋白转化子被引量：1
- 2011年
- 报道了一种筛选高表达融合蛋白HSA-IL-11的毕赤酵母转化子的免疫双膜筛选法。将生长在醋酸纤维素滤膜上的转化子进行原位诱导,再用硝酸纤维素滤膜对表达的蛋白进行原位捕捉,并经封闭过夜后使用抗HSA抗体进行免疫杂交,再用标记二抗进行显色。根据显色强弱将转化子分为强阳性、中等和阴性三类,再用抗IL-11抗体进行复筛验证。结果显示,抗HSA抗体所筛得的200株强阳性转化子中190株在抗IL-11抗体杂交验证中呈现强阳性反应,而无一株呈现阴性反应。这表明,利用免疫学方法筛选人白介素11-人血清白蛋白融合蛋白高表达菌株时,可以只使用抗HSA抗体进行一步筛选。挑选各种转化子进行摇瓶复筛和SDS-PAGE分析,结果显示,转化子融合蛋白表达量与免疫学显色反应之间呈现高度相关性,这表明利用所建立的免疫学方法筛选融合蛋白高表达转化子是可行的。
- 吴琼王亚苏婷段作营金坚李华钟
- 关键词：融合蛋白免疫学筛选
- 人血清白蛋白在乳酸克鲁维酵母中的表达被引量：1
- 2012年
- 以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis,K.lactis)GG799为宿主对人血清白蛋白(HSA)进行分泌表达。以pPIC9k-HSA为模板,采用带有XhoⅠ和NotⅠ酶切位点的引物PCR扩增获得HSA基因,经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后插入pKLAC1,构建表达载体pKLAC1-HSA。经SalⅡ线性化后,电击转化K.lactis GG799,用含5 mmol/L乙酰胺的YCB平板筛选阳性转化子。提取基因组DNA,采用PCR方法对转化子鉴定后进行摇瓶发酵。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析发酵上清液中的表达产物,并初步分析酵母基础N源(YNB)对HSA在K.lactis GG799中表达的影响。结果表明,HSA成功在K.lactis GG799中分泌表达,表达量为81μg/mL,遗传稳定性好。
- 付莉莉关波雷楗勇段作营陈蕴金坚李华钟
- 关键词：人血清白蛋白乳酸克鲁维酵母分泌表达
- 共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响被引量：3
- 2014年
- 探索共表达蛋白质折叠辅助因子Ero1、PDI和Bi P对毕赤酵母GS115分泌表达融合蛋白质IFNβ-HSA的影响。将构建的蛋白质折叠辅助因子表达载体p GAP-Ero1、p GAP-PDI、p GAPBi P和空载对照线性化后,电击转化重组毕赤酵母GS115/IFNβ-HSA细胞,用含有400μg/m L zeocin的YPD平板筛选阳性转化子,并采用PCR和Western blot法进一步鉴定。阳性转化子进行摇瓶发酵后,采用SDS-PAGE及Western blot法分析共表达Ero1、PDI和Bi P对IFNβ-HSA表达水平的影响。结果表明,Ero1、PDI和Bi P成功地在胞内过量表达,且不影响宿主细胞的正常生长;共表达Ero1和PDI分别使IFNβ-HSA的表达量提高了80%和90%,而共表达Bi P则对IFNβ-HSA的表达水平无明显影响。
- 陈凤祥关波陈蕴段作营金坚李华钟
- 关键词：毕赤酵母二硫键异构酶
- 毕赤酵母GS115表达HSA-GCSF^m的诱导工艺研究被引量：2
- 2016年
- 本文探讨了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混诱导对重组毕赤酵母GS115/p PIC9K-HSA-GCSF^m表达HSA-GCSF^m的影响。结果显示:甲醇供应充足条件下HSAGCSF^m表达水平仅为37 mg·L^(-1),而甲醇添加受限条件下HSA-GCSF^m表达水平可达到239mg·L^(-1);甲醇添加受限并添加胰蛋白胨条件下,HSA-GCSF^m表达水平可以提高到266 mg·L^(-1);在此基础上,流加山梨醇作为辅助碳源,表达水平可大幅提高至424 mg·L^(-1)。通过对各诱导条件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配进行分析后发现,将甲醇限制在低浓度同时添加胰蛋白胨与山梨醇,可以改善细胞代谢活性,增加细胞用于HSA-GCSF^m合成的碳流分配量,降低胞外蛋白酶活性,从而提高了HSA-GCSF^m的表达水平并缓解了HSA-GCSF^m的降解。因此,该诱导工艺适于毕赤酵母高效表达HSA-GCSF^m。
- 李清亮周月涵丁健段作营金坚李华钟
- 关键词：毕赤酵母山梨醇
- 全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性被引量：4
- 2013年
- 目的在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serumalbumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性。方法在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白;检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响。结果重组表达质粒经测序证实构建正确;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力;酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平。结论成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性。
- 李俊毅彭林唐存多邬敏辰金坚
- 关键词：人血清白蛋白融合蛋白组氨酸标签肠激酶
- 双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白被引量：3
- 2010年
- 以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2μg/mL和0.5μg/mL,方法的线性检测范围39.06～1250ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.4429x-1.1433,r=0.9966,灵敏度可达10.25ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%～102.94%,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。
- 张红梅李波段作营雷楗勇金坚李华钟
- 关键词：双抗体夹心ELISA融合蛋白
