浙江省自然科学基金(300466)
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
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- HAI-1基因不同功能域的原核表达载体构建及融合蛋白表达
- 2006年
- 目的:分段克隆1型肝细胞生长因子激活剂抑制因子(HAI-1)基因的功能域并在大肠杆菌中表达,为进一步研究HAI-1的生物学功能打下基础。方法:针对HAI-1的不同功能域设计相应的5对引物,分别扩增KD1、KD1+LDLR、KD2、LDLR+KD2和KD1+LDLR+KD2片段。将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体中并经测序鉴定。将5个cDNA片段亚克隆至具有6个组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pIVEX2.3-MCS中。以上述表达不同功能域的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物以Westernblot进行鉴定,并进一步通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的KD1+LDLR+KD2融合蛋白。结果:成功地构建了HAI-1各功能域基因片段的原核表达载体。Westernblot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中分段表达了5种HAI-1不同功能域的His-Tag融合蛋白,并通过亲和层析法纯化到了相对分子质量为22200的KD1+LDLR+KD2融合蛋白。结论:重组质粒pIVEX2.3-MCS/HAI-1能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的融合蛋白可用于研究HAI-1不同功能域的生物学作用。
- 曾蕾曹江
- 关键词：原核表达融合蛋白
- HAI-1过表达对SW620细胞体外生长和运动能力的影响被引量：3
- 2005年
- 肝细胞生长因子激活因子抑制因子1(hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1, HAI-1)能有效抑制肝细胞生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator,HGFA)和丝氨酸蛋白酶Matriptase的活性,并可通过对HGFA和Matriptase活性的调控参与HGF/c-Met信号传导途径。为了解HAL-1在肿瘤细胞的生长和运动中的作用,本研究将人HAI-1基因全长cDNA克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,并转染人肠癌SW620细胞,用Western blot验证了转染细胞中HAI-1的表达情况,并分别利用生长曲线、软琼脂集落形成、穿膜运动和扩散运动测定等方法检测了HAI-1 过表达对SW620细胞生长和运动能力的影响。生长曲线和软琼脂集落形成测定都显示出HAI-1 转染细胞与对照组相比差异不十分明显。穿膜运动和扩散运动测定则均显示了HAI-1过表达对细胞运动能力有明显的抑制。因此,HAI-1的过表达虽然在体外对肿瘤细胞生长影响较小,但可以抑制肿瘤细胞的运动迁移能力。
- 曹江叶景佳
- 关键词：过表达体外生长全长CDNA克隆PCDNA3
- GST-HAI-1融合蛋白的表达及抗人HAI-1单克隆抗体的制备被引量：6
- 2004年
- 制备抗人肝细胞生长因子激活物抑制因子 (HAI 1 )单克隆抗体 ,为对HAI 1进行进一步的研究打下基础。将人HAI 1cDNA分段克隆 ,构建GST HAI 1融合蛋白原核表达载体 ,转化大肠杆菌后加IPTG诱导融合蛋白表达 ,经制备型SDS PAGE法分离表达的GST HAI 1融合蛋白 ,通过割胶、电洗脱回收融合蛋白 ,并以此为抗原免疫BALB c小鼠 ,应用细胞融合技术制备产生抗人HAI 1单克隆抗体的杂交瘤 ,以ELISA、Westernblot和免疫组织化学染色进行鉴定。最终获得抗人HAI 1单克隆抗体杂交瘤细胞株ZMC6 ,产生的单克隆抗体可特异性地与表达的GST HAI 1融合蛋白反应 ,并可识别大肠组织中的膜型及脱落型HAI 1蛋白。该单克隆抗体的制备成功 ,为深入研究HAI
- 程海霞曹江沈建根郑树
- 关键词：融合蛋白单克隆抗体
