广东省科技计划工业攻关项目(2009B050700030)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：芦春斌马贞丽高忱邱建阁更多>>
- 相关机构：暨南大学更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目教育部留学回国人员科研启动基金广东省教育部产学研结合项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 重叠延伸PCR合成风疹病毒E1蛋白抗原肽基因及其表达
- 2012年
- 目的:利用重叠延伸PCR合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠延伸PCR法合成相应抗原肽段,克隆后测序鉴定。再以酶切连接的方法将合成的抗原肽序列克隆导入原核表达载体pET32a;利用IPTG诱导抗原肽段的表达,SDS-PAGE和West-ern blot法分析表达产物。结果:经过6轮重叠延伸PCR扩增,成功获得与预期目的序列一致的风疹病毒E1基因抗原肽并构建获得重组质粒pET32-rE1;在37℃下分别以终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导抗原肽表达,SDS-PAGE和Western blot法检测到预期的蛋白条带;且以IPTG终浓度为1 mmol/L诱导6 h后表达量最高。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因抗原肽段,构建其原核表达载体pET32-rE1并表达该抗原肽。
- 芦春斌邱建阁马贞丽
- 关键词：抗原肽重叠延伸PCR
- 重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体被引量：1
- 2011年
- HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。
- 芦春斌高忱
- 关键词：HPV16E6E7宫颈癌重叠PCR
- 重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建
- 2010年
- 目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列。方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RVrE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a。结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1。
- 芦春斌马贞丽
- 关键词：重叠PCR密码子优化
