国家自然科学基金(30570259)
- 作品数：10 被引量：84H指数：6
- 相关作者：田永胜陈松林刘本伟王春花季相山更多>>
- 相关机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所中国海洋大学山东农业大学更多>>
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- 不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用被引量：9
- 2007年
- 以牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同发育期胚胎为实验材料,研究了7种渗透性和5种非渗透性抗冻剂对牙鲆尾芽期和心跳期胚胎的毒性,同时对玻璃化液在不同胚胎发育期的毒性作用,以及玻璃化颗粒冷冻过程中,冷冻颗粒降温和解冻的时间进行了研究。结果表明,单一渗透性抗冻剂对牙鲆胚胎的毒性随着抗冻剂浓度的升高、平衡时间的延长而提高,其毒性由大到小依次为乙二醇(EG)、酒精(EtOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1,2-丙二醇(PG)。非渗透性抗冻剂中聚乙烯吡咯酮(PVP)对牙鲆尾芽期胚胎的毒性最强,其次是蔗糖和D果糖,葡聚糖和葡萄糖毒性最弱。在总体积分数一定的情况下,PG、MeOH与DMSO体积比为9∶6∶5的混合抗冻剂对牙鲆尾芽期胚胎毒性最低;各发育期胚胎经过玻璃化液平衡后,尾芽期以前胚胎的成活率随胚胎发育期逐渐升高,心跳期以后逐渐降低,尾芽期和心跳期成活率最高。含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温时间最短为15.09 s,解冻时间最短为6.22 s;而不含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温和解冻时间分别为(13.83±1.86)s和(7.20±0.90)s。将PG、MeOH与DMSO按体积比9∶6∶5配成总体积分数为35%的混合溶液,再添加5%的蔗糖配制成玻璃化液,采用此玻璃化颗粒冷冻方法对173粒牙鲆尾芽期至心跳期胚胎进行超低温冷冻保存,解冻后共获得4粒成活胚胎。
- 刘本伟陈松林田永胜孔晓瑜王春花
- 关键词：抗冻剂玻璃化
- 牙鲆胚胎玻璃化冷冻及解冻过程中的温度因子与玻璃化率被引量：2
- 2008年
- 为避免鱼类胚胎玻璃化冷冻过程中脱玻璃化现象发生，本文对冷冻过程中温度变化及解冻方法进行了研究。在室温13℃下，将含有玻璃化液FVS3的麦管直接投入到-196℃的液氮中，麦管内温度达到-196℃时，所用的时间为15．46±1．38S，降温速率为800℃／min。对玻璃化麦管在35～45。C水浴中解冻时间进行测定。结果显示，解冻所需时间在6．17～7．94S之间，麦管从-196℃升高到13℃的解冻速率为1500～2000℃／min。当水浴温度从37℃逐步升高到72℃时，对水浴表面蒸气温度的变化进行了测定，相应水温下蒸气温度从25．47℃升高到38．6℃。在麦管中加入不同浓度的玻璃化液FVS1、FVS2、FVs3和FVS4进行玻璃化冷冻，然后将麦管分别在37℃水浴中和28．6℃的蒸气中解冻时玻璃化率进行研究。结果显示，在蒸气中解冻时的玻璃化率明显高于水浴中解冻；麦管玻璃化率在水浴中解冻时不稳定，在蒸气中解冻时表现稳定，玻璃化率随着玻璃化液浓度的升高有逐渐升高的趋势。对含有牙鲆胚胎的玻璃化冷冻麦管分别在37℃水浴和28．6℃蒸气中解冻，结果表明，蒸气中解冻时的玻璃化率同样明显高于水浴中解冻。
- 田永胜刘本伟陈松林
- 关键词：牙鲆胚胎玻璃化冷冻
- 利用显微注射技术冷冻保存牙鲆胚胎被引量：2
- 2008年
- 在鱼类胚胎的冷冻保存中,需要抗冻剂有效地渗入胚胎,才能对胚胎起到保护作用。本研究采用显微注射技术将抗冻剂直接注射到牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎内,以实现牙鲆胚胎的玻璃化低温冷冻保存。研究中,首先对抗冻剂种类进行了选择,将抗冻剂的毒性由大到小依次排列为：乙二醇（EG）、甘油（Gly）、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇（MeOH）、1,2丙二醇（PG）、PM21（PG∶MeOH=2∶1）;对胚胎发育时期和注射剂量进行了筛选。实验结果显示,注射600pL（1pL=10-6mL）抗冻剂PM21后,牙鲆的心跳期胚胎成活率显著高于尾芽期胚胎（P〈0.05）,成活率为（64.04±2.05）%;对卵黄囊、卵膜与卵黄膜间隙作为注射部位进行了选择,发现采用卵黄囊内注射的胚胎成活率高于＂五步平衡法＂,并显著高于通过卵黄膜间隙注射（P〈0.05）,其成活率为（44.24±7.88）%。结果表明,注射600pL35%PM21至牙鲆心跳期胚胎卵黄囊内,平衡10min,然后进行玻璃化冷冻保存,取得了68.2%~79.4%透明胚胎,能够对牙鲆胚胎提供很好的保护。说明显微注射方法可以成功地将抗冻剂注射入牙鲆胚胎,并在牙鲆胚胎的冷冻及胚胎的完整性方面发挥有效的保护作用。
- 丁浩田永胜武鹏飞刘洋陈松林
- 关键词：牙鲆胚胎显微注射玻璃化冷冻保存
- 牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究被引量：7
- 2007年
- 以牙鲆胚胎为材料，对胚胎程序化冷冻保存的主要环节进行了探讨，以优化牙鲆胚胎的程序化超低温冷冻保存法。单一抗冻荆的毒性试验表明甲醇（Methanol）、1，2-丙二醇（PG）的毒性低于其他抗冻剂的毒性。混合抗冻剂的毒性试验表明，20％～25％PM抗冻剂的毒性很低，经其平衡处理的胚胎，冷冻至-30℃，成活率可达80％以上。植冰前采用2℃／min的降温速率，从植冰后到入液氮前温度采用8℃／min的降温速率效果较好。入液氮前温度的筛选实验表明，入液氮前的温度以-45℃较好。利用20％PM和22％PMP，采取优化的降温程序冷冻保存尾芽期的牙鲆胚胎，分别获得5枚和7枚复活胚胎，并全部孵化出膜。
- 王春花陈松林田永胜刘本伟邓寒
- 关键词：牙鲆胚胎冷冻保存
- 显微注射抗冻剂对牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎毒性及冷敏感性的影响被引量：4
- 2009年
- 在鱼类胚胎冷冻保存中,由于胚胎体积大、卵膜具多层结构,并且通透性差,传统的平衡法无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护作用。为弥补了普通平衡法的不足,此研究利用显微注射技术,将抗冻剂直接注射到鱼类胚胎卵黄囊内,提高了抗冻剂对胚胎的保护程度。此研究以牙鲆胚胎为试验材料,对显微注射抗冻剂种类、抗冻剂的注射剂量、注射浓度、以及抗冻剂注射后胚胎的冷敏感性影响进行了筛选。结果表明:牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl;几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为PVP>蔗糖,DMSO>MeOH>PG,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加;另外,在冷敏感试验中,显微注射6mol/L的PM的胚胎胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率由室温降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为(25.07±1.57)%,而6mol/的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为(20.88±2.84)%,说明显微注射的胚胎冷敏感性一定降低。
- 武鹏飞丁浩田永胜陈松林
- 关键词：显微注射
- 鱼类精子质量评价研究进展被引量：26
- 2007年
- 在鱼类人工繁育中,研究者主要关心的是卵子质量,长期以来对精子质量未引起足够重视。而精子质量同样会影响繁育效果的重要因素。鱼类精子质量的评价指标有多种,如精子活力、运动时间、密度、形态、受精率和生理功能等。其中最传统的评价指标是精子活力,其测定方便,能较准确地预测受精率。将精子运动时间和活力综合考虑可更好地反映精子的运动能力。而精子受精率则是精子质量的直接反映,但会受到卵质等因素的影响。质膜完整性、线粒体功能、染色质结构完整性等可体现精子的质量,但测定方法较繁琐。近年来,鱼类精子质量检测技术迅速发展,计算机辅助精子分析(CASA)、流式细胞术(FCM)分析、低渗肿胀(HOS)、单细胞凝胶单泳(SCGE)等技术的建立,使得测定指标更多样、客观、准确。本文逐一介绍了评价精子质量的各种指标,并对各指标的测定方法、测定原理、国内外研究情况进行详细叙述,旨为我国鱼类精子质量评价研究提供背景资料。
- 季相山陈松林赵燕田永胜
- 关键词：鱼类精液
- 半滑舌鳎精子冷冻保存被引量：14
- 2009年
- 半滑舌鳎精子冷冻保存对于人工繁殖育苗、杂交育种、雌核发育及其性别控制研究具有重要的意义,为此,本文对半滑舌鳎精子冷冻保存方法进行了研究。分别利用2.8mol/L的二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)和1,2-丙二醇(PG)冷冻保存该鱼精子。结果显示,DMSO冷冻保存精子的活力较高。利用MPRS+2.8mol/L DMSO以1∶0.5、1∶1、1∶1.5和1∶2的比例稀释并冷冻精子,1∶1比例在冻前能够抑制精子的运动,冻后活力可达82.50±3.54%,显著高于其他稀释比例(P<0.05)。分别利用冷冻保存液A(MPRS+2.8mol/L DMSO)和B(TS-2+2.8mol/L DMSO)稀释平衡精子,精子在A中的冻前快速运动时间、寿命分别为37.75±6.45s和145.00±78.98s,与鲜精无显著差异(P>0.05)。利用以上两种冷冻稀释液冷冻保存精子,精子在A液中的冻后活力和寿命分别可达53.50±6.69%和98.00±13.51s,冷冻效果优于B液(P<0.05)。冷冻后精子的受精率和孵化率分别为55.00±5.00%和35.00±13.23%,受精率与鲜精无显著性差异(P>0.05),因此认为MPRS+2.8mol/LDMSO可用于半滑舌鳎精子的冷冻保存。
- 田永胜陈松林季相山孙礼娟翟介明
- 关键词：半滑舌鳎精子冷冻保存
- 异源冷冻精子诱导大菱鲆的雌核发育被引量：18
- 2008年
- 采用冷冻保存的鲈（Lateolabraxjaponicus）精液不经紫外线照射直接与大菱鲆（Scophthalmusmaximus）卵进行杂交，可以刺激大菱鲆卵进行胚胎发育，胚胎发育率（发育至原肠期后胚胎成形的卵占总卵数的百分比）可达79．1％。通过与精子照射组单倍体发育过程等对比观察发现，杂交后代为大菱鲆的单倍体。如果在“受精”后2～10min内将大菱鲆卵在0～6℃冷休克处理10～50min，均能诱导卵子染色体加倍。对冷休克处理条件的筛选结果表明，在0℃条件下，卵子在受到鲈鱼精子刺激后6min开始进行冷休克处理25min，二倍体孵化率（雌核二倍体苗占受精卵的百分比）最高，可达34．8％。通过对各实验组卵发育情况的跟踪观察，发现单倍体与雌核发育二倍体在发育过程中有明显的差异，这种差异最早出现在8细胞期。单倍体胚胎头部发育不正常，眼泡较小，身体短且扭曲较严重，从肌节期开始沉积大量的黑色素颗粒。仔鱼孵化1周内单倍体即全部死亡。与正常二倍体对照组相比较，证明所得正常形态仔鱼即为雌核发育二倍体。
- 苏鹏志陈松林杨景峰田永胜翟介明孙礼娟
- 关键词：大菱鲆精子雌核发育冷休克
- 牙鲆胚胎冷冻损伤的观察
- 2009年
- 为了观察牙鲆胚胎在冷冻保存过程中的形态受损情况,将其浸入20%PM(20%丙二醇和20%甲醇1∶1的混合液)中平衡,并用程序化法和玻璃化法对其冷冻保存2h后解冻,用摄影显微镜记录其在抗冻剂里平衡时和冷冻保存后的形态。结果显示在平衡过程中胚胎卵膜出现凹陷(称为溶液损伤),但可以恢复;在冷冻过程出现胞内冰损伤,是致命的;用程序化法冷冻保存的尾芽期胚胎卵膜和卵黄完好,胚体边缘受伤;用玻璃化法保存的尾芽期胚胎,卵膜和卵黄损伤较重,胚体损伤较轻;因此将玻璃化法和程序化法结合可以达到扬长避短的效果。
- 王春花田永胜
- 关键词：牙鲆胚胎
- 鲈鱼冷冻精子诱导半滑舌鳎胚胎发育被引量：14
- 2008年
- 半滑舌鳎是分布在我国黄、渤海的特有鱼类，雌鱼明显具有较雄鱼生长快的特点，利用雌核发育方法诱导产生半滑舌鳎超雌鱼，通过与正常雄鱼交配，最终可培育生长速度快、个体大的全雌性后代，对于提高养殖效益具有重要的意义。为此利用冷冻保存的异源鲈鱼精子诱导半滑舌鳎卵产生雌核发育二倍体、单倍体、杂交胚胎，利用同源精子受精产生普通二倍体，在Olympus显微镜下对它们的胚胎发育进行了观察比较。冷冻解冻的鲈鱼精子，在1000μj／cm^2紫外线下照射0．2～1min，诱导半滑舌鳎卵受精，在受精后2～5min将卵置于2～5℃的水浴冷休克20min，获得了雌核发育的胚胎和鱼苗，在21．7～23．6℃水温中，雌核发育胚胎经过2781min孵化出膜。普通胚胎在21．7～23．6℃水温下，经2621min孵化出膜。经紫外线灭活处理的鲈鱼精子诱导半滑舌鳎卵，但不经过冷休克获得的单倍体胚胎，具有明显的单倍体综合症，发育至1949min陆续死亡。鲈鱼精子与半滑舌鳎卵杂交受精，胚胎不能正常发育，相当于胚孔封闭期后全部死亡。实验证明，鲈鱼冷冻精子可刺激半滑舌鳎卵雌核发育。
- 田永胜陈松林邵长伟刘本伟庄志猛
- 关键词：半滑舌鳎鲈鱼冷冻精子雌核发育胚胎发育
