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无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达被引量：6: 2014年; 以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。; 王培鲁义善王蓓汤菊芬蔡佳吴灶和简纪常; 关键词：吉富罗非鱼免疫球蛋白M 原核表达蛋白免疫印迹

红笛鲷T淋巴细胞酪氨酸激酶的原核表达及多克隆抗体制备被引量：2: 2013年; 为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后进行IPTG诱导表达。通过表达条件的优化,重组蛋白在37℃、0.03 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后获得最大表达量,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测重组蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,表明为目的蛋白。利用纯化后的rLS-LCK重组蛋白免疫小鼠,获得了1∶40 000高效价的抗血清,Western blot分析显示,融合蛋白能被小鼠的阳性血清识别,说明rLS-LCK融合蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。; 黄瑜张雪利蔡佳简纪常吴灶和鲁义善樊云霞; 关键词：红笛鲷原核表达 BLOT分析抗原性分析

红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化被引量：6: 2013年; 克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。; 黄瑜张雪利鲁义善简纪常吴灶和黄浦江周泽军; 关键词：红笛鲷原核表达纯化 WESTERN BLOT分析

红笛鲷IRAK-4基因cDNA全长的克隆及组织表达分析被引量：3: 2015年; 白细胞介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4）是一种参与机体先天性免疫和适应性免疫反应过程中的关键分子。采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增（RACE-PCR）的方法从红笛鲷（Lutjanus sanguineus）头肾中克隆IRAK-4基因的c DNA全序列（登录号：KF279357）。该序列全长2 015 bp,包含5′非编码区（5′UTR）205 bp,3′非编码区（3′UTR）421 bp,开放阅读框（ORF）1 389 bp,编码462个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为52.0 ku,理论等电点为5.19。氨基酸序列比对结果显示,红笛鲷IRKA-4基因氨基酸序列与其他物种的同源性为54.2%~85.7%。系统进化分析结果显示,红笛鲷与斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）聚为一支,两者有较近的亲缘关系。用荧光定量PCR分析红笛鲷基因的组织表达差异,红笛鲷IRKA-4基因在各组织中均有不同程度的表达,其中在皮肤、肝脏和胃中表达量最高,其次是胸腺、鳃、心脏、肠、肌肉和脾脏,在头肾、后肾和脑的表达量最低。; 黄郁葱鲁义善简纪常吴灶和; 关键词：红笛鲷 IRAK-4 基因克隆

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化被引量：1: 2013年; 以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。; 黄浦江黄郁葱简纪常吴灶和鲁义善黄瑜樊云霞; 关键词：基因融合

Characterization and Expression Analysis of B Cell Receptor Accessory Molecule CD79 Gene in Humphead Snapper(Lutjanus sanguineus): 2016年; CD79,a key component of the B cell antigen receptor complex,is composed of CD79α(Igα) and CD79β(Igβ) encoded by mb-1 and B29 respectively,and plays an important role in B cell signaling.In this study,we isolated and characterized mb-1 and B29 from humphead snapper(Lutjanus sanguineus).Their tissue distribution and expression profiles after stimulations in vitro and in vivo were also investigated.The humphead snapper mb-1 and B29 contain open reading frames of 684 bp and 606 bp,encoding 227 amino acids and 201 amino acids,respectively.Both CD79α and CD79β possess signal peptide,extracellular Ig domain,transmembrane region and immunoreceptor tyrosine kinase activation motif(ITAM).Mb-1 is highly expressed in lymphoid organs(thymus,posterior kidney and spleen) and mucosal-associated lymphoid tissues(gill and intestine),while B29 is mainly detected in posterior kidney,spleen,gill and skin.Furthermore,transcription of mb-1 and B29 in head kidney leucocytes was up-regulated following lipopolysaccharide(LPS),pokeweed mitogen(PWM),and polyinosinic-polycytidylic acid(Poly I:C) stimulation,respectively,and their expression level in anterior kidney and spleen was also increased after challenged with formalin-inactived Vibrio harveyi.These results indicated that humphead snapper CD79 molecule might play an important role in immune response to pathogen infection.; HUANG YucongYANXiuyingCAI ShuanghuCAI JiaJIAN JichangLU Yishan3,4TANG JufenWU Zaohe; 关键词：细胞受体受体酪氨酸激酶

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果被引量：7: 2013年; 参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列，设计引物扩增OmpW的开放阅读框，序列分析结果显示该基因全长645bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（＋），在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白，融合蛋白分子量约为43．8ku，且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37oC，IPTG浓度0．1mmol／L，诱导时间5h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体，ELISA方法检测抗体效价达1：30000，Western．Blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应，提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果，构建了真核表达重组质粒pcDNA-OmpW，然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示，免疫接种后第7—28天，在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织中均存在质粒分布；RT．PCR结果显示，免疫接种后第7～28天，红笛鲷上述组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明，红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western．Blot分析表明，DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白，并诱导产生了相应抗体。攻毒实验结果表明，免疫保护率高达60％，可见pcDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈维氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。; 黄浦江黄郁葱简纪常吴灶和鲁义善张雪利; 关键词：哈维氏弧菌外膜蛋白免疫原性 DNA疫苗

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达被引量：2: 2013年; 根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。; 樊云霞简纪常鲁义善吴灶和; 关键词：红笛鲷原核表达

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国家自然科学基金(41240041)

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