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布鲁杆菌BP26重组卡介苗的构建及对小鼠CD4＋和CD8＋T细胞的影响被引量：3: 2012年; 目的构建预防布鲁杆菌病的新型疫苗——布鲁杆菌BP26重组卡介苗（rBCG—BP26），观察rBCG—BP26对免疫小鼠CD4＋．CD8＋T细胞的影响。方法利用常规分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B—BP26，电转入卡介苗（BCG）后经过卡那霉素抗性筛选，对获得的基因重组株进行PCR鉴定。采用Western免疫印迹法检测菌体和液体培养基中BP26蛋白表达情况。选用45只BALB／c小鼠进行安全性实验分析，将其分成3组：目标实验（rBCG—BP26）组、阳性对照（BCG）组、阴性对照（PBS）组，每组15只。分别在小鼠皮内接种100μl rBCG—BP26[含106克隆形成单位（CFU）]、BCG、PBS。观察各组小鼠体征，在小鼠免疫后的第10、20、30、40天称量体质量，并于尾部采血，用流式细胞仪分析CD4＋,CD8＋T细胞含量。结果成功构建rBCG—BP26重组疫苗株。在菌体和液体培养基中均能检测到BP26蛋白的表达。安全性实验分析表明，3组小鼠在免疫后第10、20、30、40天体质量比较，差异无统计学意义[rBCG—BP26组分别为（19．16±0．55）、（20．89±O．20）、（22．15±0．76）、（24．60±0．64）g；BCG组分别为（19．90±0．02）、（21．53±1．57）、（21．95±0．55）、（24．70±0．39）g；PBS组分别为（19．24±0．54）、（21．37±0．66）、（22．83±0．62）、（25．06±0．37）g；F值分别为2．468、0．331、1．520、0．739，P均〉0．05]。在免疫后第10、20天时，rBCG—BP26组小鼠全血CD4^＋T细胞含量（13．40％、26．70％）低于BCG组（26．70％、33．07％）和PBS组（33．85％、29.33％），rBCG—BP26组CD4＋／CD8＋T细胞含量比值随时间延长而逐渐增长（0．69％、1．27％、1．57％、1．70％）。结论rBCG-BP26能高效表达布鲁杆菌BP26蛋白，并具有毒力弱、能激活机体CD4＋、CD8＋T细胞的特点，可作为预防布鲁杆菌病的疫苗候选株之一。; 诸婷婷张璘陈创夫王远志柳建新王慧; 关键词：布鲁杆菌疫苗卡介苗

新疆喀什维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌5个VNTRs基因分型研究: 2010年; 目的:应用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple loci VNTR analysis,MLVA)技术,对新疆喀什地区维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,探讨5个数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法:收集结核分枝杆菌,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,结合BioNumerics5.0软件,对其5个VNTR位点进行结果分析。结果:分离出58株结核分枝杆菌,分为4个基因群21个基因型,分别为Ⅰ群占19.1%,含7个基因型;Ⅱ群占3.4%,含2个基因型;Ⅲ群占67.2%,含9个基因型;Ⅳ群占10.3%,含5个基因型。结论:新疆喀什地区维吾尔族结核病患者的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,且存在主要流行菌群。; 米利古王远志李永祥任晓霞艾尔肯江.孜帕尔吴长东曹红艳袁俐; 关键词：结核分枝杆菌维吾尔族基因分型

绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究被引量：2: 2010年; 目的证实新疆分离绵羊附睾种布鲁氏菌019株与参考菌株的差异性。方法采用PCR扩增绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白的Omp31、Omp25、Omp22、Omp2a、Omp2b基因,并进行序列比较分析。结果绵羊附睾种布鲁氏菌019株的5种外膜蛋白基因序列与绵羊种布鲁氏菌参考株在核苷酸水平和氨基酸水平上均存在差异。结论绵羊附睾种布鲁氏菌019株是独特的新疆地方株。; 王远志陈创夫崔步云曹旭东张辉; 关键词：外膜蛋白基因 PCR

实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用被引量：1: 2010年; 目的通过实时定量PCR(real-ti me PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(si RNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FTH1(ferritin heavy chain1,FTH1)基因表达mRNA的si RNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总RNA,逆转录为cDNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FTH1基因mRNA的量。结果 3种si RNA处理的小鼠巨噬细胞中FTH1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。; 杜军伟王远志陈创夫葛阳春唐利燕; 关键词：实时定量PCR SIRNA

载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用: 2010年; 目的构建小鼠巨噬细胞半乳糖特异性凝集素(GSL)靶向的RNAi质粒载体,研究其对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的沉默作用。方法根据GSL核苷酸序列,合成3条特异性双链小干扰RNA(siRNA)分子,退火形成双链,分别连接到RNAi-Readyp SIREN-RetroQ-ZsGreen Vector,转化大肠杆菌得到阳性克隆,经测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BALB/c小鼠,应用实时定量PCR和免疫组化法评价siRNA载体对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的抑制作用。结果 siRNA载体对小鼠体内GSL基因的抑制率为84-96%,对巨噬细胞GSL基因的抑制率可达61.98%～83.02%。结论构建的siRNA载体能有效抑制目的基因在体内外的表达,该结果为分析半乳糖特异性凝集素在布鲁氏菌侵染过程中的功能奠定了基础。; 葛阳春王远志陈创夫杜军伟胡圣伟; 关键词：RNAI 小鼠

羊种布鲁杆菌诱导小鼠巨噬细胞的凋亡及caspase3、8、9对细胞凋亡的调控被引量：2: 2013年; 目的观察羊种布鲁杆菌强毒株16M和减毒株M5-90诱导小鼠巨噬细胞RAW264．7凋亡的差异性，以及半胱氨酸蛋白酶（caspase）3、8、9对细胞凋亡的调控作用。方法通过羊种布鲁杆菌16M、M5-90对小鼠巨噬细胞多重感染（细菌数：细胞数=100：1、10：1、50：1）的方式，找出最佳感染复数（MOI）。按最佳MOI=50：1建立布鲁杆菌16M、M5-90感染巨噬细胞的模型，分别在感染后2、4、8、12、24、48h后收集被感染的细胞，计数细胞内细菌菌落形成数量单位，流式细胞仪检测细胞凋亡率及caspase3、8、9对细胞凋亡的影响。结果在感染后2、4、8、12、24、48h，16M在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^5.4、10^4.8、10^5.8、10^6.5、10^8.0、10^9.0，M5-90在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^6.1、10^6.2、10^6.4、10^6.3、10^6.1、10^5.0，其中在感染后24、48h，强毒株16M较弱毒株M5-90在细胞内寄生菌菌落形成数量明显增加。在感染后2、4、8、12、24、48h，16M诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（2．67±0．09）％、（13．13±0．3）％、（6．56±0．42）％、（6．49±0．28）％、（16．07±0．86）％、（24．23±1．67）％，M5-90诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（3．62±0．02）％、（32．01±2．59）％、（17．58±0．44）％、（16．09±0．10）％、（62．53±2．70）％、（85．53±0．15）％。对照组巨噬细胞凋亡率分别为[（1.90±0．20）％、（1．92±0．16）％、（1．99±0．03）％、（2．48±0．11）％、（3．56±0．07）％、（5．26±0．33）％]，各组同时间两两比较差距均有统计学意义（P均〈0．01）。其中在感染后24-48h，弱毒株M5-90比强毒株16M更能促进巨噬细胞的凋亡。在感染后24h，对照组caspase3、8,9的表达量分别为（1．47±0．05）％、（1．52±0．02）％、（2．47±0．12）％，M5-90组caspase3、8、9的表达量分别为（9．70±0．46）％、（6．08±0�; 任晓莉王远志陈创夫张亚丽王慧张璘; 关键词：巨噬细胞细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶

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兵团博士基金(2009JC15)

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