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基于分子倒置探针的乙型肝炎病毒耐药基因单碱基突变检测技术的建立被引量：1: 2014年; 目的建立一种检测乙型肝炎病毒耐药基因单碱基突变的分子倒置探针（MIP）检测技术。方法方法学建立。收集第三军医大学大坪医院检验科分离的乙型肝炎病毒（HBV）耐药突变YVDD的野生株和突变株DNA。以HBV耐药基因突变YVDD为研究对象，建立针对该基因突变位点的MIP检测技术。分别采用构建的MIP技术和测序技术对1例HBV耐药突变YVDD野生株和1例突变株进行检测，通过比较MIP技术和测序技术的检测结果，明确MIP技术在临床标本检测中的准确性。结果MIP技术用于单碱基突变检测时采用TaqDNA连接酶和AmpligaseDNA连接酶进行热循环单碱基延伸及连接反应可保证检测的特异性。MIP检测技术的最佳探针浓度为1nmol/L。通过对不同浓度靶序列的检测确定MIP技术的检测灵敏度为1nmol/L。临床标本初步验证发现，MIP技术检测结果与测序方法结果一致。结论成功建立了检测HBV耐药基因单碱基突变的MIP技恭o（中华检验医学杂志。2014，37：337-341）; 唱凯贾双荣潘锋李发科王丰鲁卫平邓少丽陈鸣; 关键词：肝炎病毒乙型病毒分子探针技术单核苷酸

基于滚环扩增技术的蛋白质高灵敏检测被引量：1: 2012年; 目的:基于滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)结合免疫反应建立一种蛋白质的高灵敏检测方法。方法:根据双抗体夹心法原理,以链酶亲和素为桥梁,生物素修饰的单链寡核苷酸引物可以高亲和力地链接到生物素标记的免疫复合物上,建立蛋白质的滚环扩增技术检测平台,并将其用于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的检测。结果:在优化实验条件下,对VEGF检测的灵敏度达到10fM。结论:与常规的酶标二抗体系ELISA法相比,本方法具有更高的灵敏度,适于低丰度蛋白质的检测,此方法的进一步完善将为疾病新的蛋白标志物的筛选以及临床诊断提供有力的工具。; 张俊曾照芳鲁卫平; 关键词：滚环扩增 VEGF 高灵敏度蛋白质检测

Gamma-PNA型表面等离子共振基因芯片的构建及性能研究被引量：1: 2013年; 建立一种基于Gamma-肽核酸(Gamma-PNA)探针的表面等离子体共振(SPR)基因芯片检测系统,提高检测的灵敏度和特异性。通过自组装分子单层(SAM)技术构建二维结构的表面化学;通过生物信息学方法设计Gamma-PNA,并固定于SAM修饰的SPR芯片表面,优化并确定实验的相关参数。结果表明,Gamma-PNA探针受缓冲液盐离子浓度影响较小,在盐离子浓度为0时仍有良好的杂交反应,并且Gamma-PNA受pH值影响较小,酸性环境更利于杂交。Gamma-PNA探针和传感器技术相结合,既实现了探针的无需标记和实时检测,又提高了杂交的效率和稳定性,为临床应用奠定了基础。; 欧青叶顾大勇张妮奇何建安邵永红史蕾刘春晓赵纯中徐云庆; 关键词：表面等离子体共振基因芯片

利用超分支滚环扩增技术检测miR-21: 2014年; 目的利用超分支滚环扩增(hyper-rolling cycle amplification,HRCA)技术建立一种检测microRNA的方法。方法以miR-21为研究对象,设计特异的逆转录引物及锁式探针。通过对不同浓度的模板及不同的microRNA进行检测来研究本方法的灵敏度和特异性。结果通过对反应条件进行优化,100 nmol/L的锁式探针在Taq DNA连接酶作用下46℃连接30 min,Bst DNA聚合酶作用下60℃反应50 min,可实现靶序列最大效率的扩增。该方法特异性好,最低检测浓度为10 pmol/L。结论 HRCA技术灵敏度高、特异性好,无需特殊昂贵的仪器,且简单易操作,能够应用于microRNA检测。; 郭仲莉曾照芳鲁卫平; 关键词：MIR-21 锁式探针

生物传感器在microRNAs检测中的应用与挑战被引量：1: 2015年; MicroRNAs（miRNAs）是内源性的非编码的小RNA，参与调控多种生理学和病理学的过程，其中miRNAs检测是研究其生物功能的重要环节。相比于传统检测方法，生物传感器具有操作简单、快速、灵敏、准确、可实时检测等优势，在miRNAs检测领域有巨大的应用前景。; 陈鸣; 关键词：生物传感器 MICRORNAS

利用滚环扩增技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因单碱基突变被引量：3: 2013年; 目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板、非结核分枝杆菌基因序列模板及不同比例的突变型模板和野生型模板混合样本的检测,研究本实验方法的特异性和灵敏度。建立特异性地检测rpoB基因单碱基突变的滚环扩增方法。通过对临床样本的检测并与测序结果比较,评价该方法的临床应用价值。结果通过优化反应条件,应用滚环扩增技术能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的单碱基突变。通过对含有不同比例突变型模板的混合样本检测,最低能检测出1%突变型/野生型模板的样本。80株临床样本的检测与测序结果一致。结论滚环扩增技术特异性高、灵敏度高,无需特殊昂贵仪器且简单易操作,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,是具有临床应用前景的方法。; 张江峰张亚丽曾照芳顾大勇鲁卫平; 关键词：滚环扩增结核分枝杆菌耐药 RPOB基因

不对称重组酶介导扩增结合分子信标检测金黄色葡萄球菌方法的建立与应用被引量：1: 2017年; 目的建立一种基于重组酶介导扩增技术（RAA）与分子信标相结合的病原菌恒温快速检测方法。方法方法学的建立。通过金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）所对应的基因设计相应引物及分子信标探针，不断调整引物浓度比例以确定最佳引物浓度比来进行不对称扩增，利用不对称重组酶介导扩增并与分子信标探针杂交，通过琼脂糖凝胶电泳及荧光采集观测结果。将阳性质粒以10倍的梯度稀释，检测该方法的灵敏度。利用该RAA杂交法检测大坪医院检验科微生物室保存的2016年12月的72株包含金黄色葡萄球菌及葡萄球菌属其他种细菌的菌株，以检测该方法的特异性。在特异性实验基础上添加我室保存的2016年12月的39例其他菌株进行Kappa一致性检验及临床诊断效能评价。结果当限制性引物与非限制性引物的浓度比例在1∶20时，产生单链DNA（ssDNA）的效率最高。不对称RAA扩增与分子信标探针杂交的效率明显高于对称扩增。该方法的灵敏度为20拷贝/μl。RAA杂交法能够将金黄色葡萄球菌与葡萄球菌属其他菌株区分，与传统金标准相比Kappa为0.860，一致性良好。经过对111株菌株的检测，该方法敏感度为92.5%（37/40），特异度为97.2%（69/71），阳性预测值为94.9%（37/39），阴性预测值为95.8%（69/72），阳性似然比为33.04，阴性似然比为0.077，约登指数为0.897。与传统金标准相比，Kappa为0.902，两种方法一致性良好。结论通过对不对称RAA扩增条件的优化及与分子信标探针的结合，建立了RAA杂交技术检测细菌DNA的新方法，为恒温扩增应用于临床奠定基础。; 周琳徐欢杨成张峰领罗杰蒋文斌汪超唱凯鲁卫平陈鸣; 关键词：金黄色葡萄球菌核酸扩增技术分子探针

基于核酸适配子的高灵敏的ATP检测研究被引量：1: 2013年; 目的:根据ATP核酸适配子与ATP结合的能力强于其互补核酸的原理,构建基于核酸适配子的高灵敏的ATP检测方法。方法:以ATP核酸适配子作为识别分子,对检测的捕获探针固定浓度、杂交时间、ATP反应时间、银染增强时间等进行优化,在优化的反应条件下,对其敏感性、特异性进行评价。结果:在优化的反应条件下,通过对不同浓度的ATP样本进行检测,发现ATP浓度在10-14M至10-9M范围内时,ATP浓度的对数与灰度值的相对强度呈线性关系,相关系数为0.996。并且,在优化的反应条件下,该方法对ATP的检测具有较高的特异性。结论:所构建的基于核酸适配子的ATP检测方法具有灵敏度高、特异性高的优点,可为其他生物分子的检测提供新的思路。; 何大莉鲁卫平曾照芳; 关键词：DNA芯片 ATP

RCA技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变被引量：1: 2013年; 目的:应用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术以DNA芯片为载体建立一种对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法:根据结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因序列,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针,及固定于基因芯片上的捕获探针。针对临床结核分枝杆菌样本的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因常见突变位点的特异性DNA片段。将与突变型特异性互补结合并环化的锁式探针与芯片上固定的捕获探针进行杂交,并运用滚环扩增技术,将含有生物素标记的dUTP掺入扩增产物,最后通过与亲和素标记的纳米金反应,并银染增强显色。同时与临床样本的测序结果比较。结果:通过优化反应条件,能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的单碱基突变,通过对临床样本的检测,结果与测序结果一致。结论:该方法结合了DNA芯片和滚环扩增技术,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,具有高特异性、高灵敏度。; 张江峰张亚丽曾照芳; 关键词：滚环扩增 DNA芯片 RPOB基因

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国家自然科学基金(81171667)

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