国家自然科学基金(31201352)
- 作品数：9 被引量：12H指数：2
- 相关作者：王慧李涛王琴罗森黄振武更多>>
- 相关机构：军事医学科学院遵义医药高等专科学校中国疾病预防控制中心营养与健康所更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定被引量：4
- 2015年
- 目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。
- 罗森齐芬芳宫路路刘昊李涛王慧
- 关键词：原核表达
- A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究
- 2016年
- 目的利用基因工程方法原核表达N-His标签的A型肉毒毒素轻链(Bo NT-ALC)蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体p ET22b-ALC,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP-25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的Bo NT-ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。
- 卢晓雪赵缓黄彦杰李涛王慧
- 关键词：A型肉毒毒素蛋白纯化金属蛋白酶类
- 牛磺酸对缺氧所致神经胶质细胞凋亡的抑制作用
- 2015年
- 目的探讨牛磺酸对缺氧引起的神经胶质细胞凋亡的抑制作用方法原代培养神经胶质细胞并制作细胞缺氧模型,实验分为空白对照组、缺氧模型组、缺氧+牛磺酸组。细胞缺氧6 h后加入牛磺酸3 mmol/L继续培养24 h和48 h。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测凋亡相关基因表达水平。结果缺氧组48 h早期凋亡率为(2.48±0.92)%,中晚期凋亡率为(2.97±0.75)%,均显著高于对照组的(1.02±0.44)%(P<0.05);牛磺酸48 h组早期凋亡率为(1.39±1.03)%,中晚期凋亡率为(1.62±0.1)%,均显著低于缺氧组(P<0.05)。缺氧组Bax mRNA相对表达量均显著高于对照组和牛磺酸组(P<0.01);牛磺酸48 h组Bcl-2 mRNA相对表达量比缺氧组升高2倍(P<0.01);牛磺酸组HIF-1αmRNA表达量均比缺氧组升高显著(P<0.01)。结论牛磺酸有助于抑制缺氧所致的神经胶质细胞早期和中晚期凋亡率。
- 王琴黄慧玲黄振武
- 关键词：牛磺酸神经胶质细胞缺氧凋亡
- B型肉毒毒素轻链的高效制备及活性鉴定被引量：3
- 2018年
- 目的:在大肠杆菌中高效表达B型肉毒毒素轻链(BoNT/BLC)并纯化,研究其生物学活性。方法:根据报道的BoNT/B LC基因序列设计引物,从肉毒梭菌中扩增BoNT/BLC基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,构建重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,在20℃条件下用IPTG诱导目的蛋白表达,表达产物经His Trap FF柱纯化,用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析。结果与结论:构建了重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,BoNT/BLC表达量达到了细菌总蛋白的30%左右,通过一步亲和纯化目的蛋白后经SDS-PAGE检测其纯度在95%以上,制备的重组LC的酶活略高于B型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于BoNT/BLC抑制剂高通量体外检测方法的研究。
- 罗森陈芳红李涛王慧
- 关键词：肉毒毒素原核表达
- 突触小泡膜蛋白VAMP-2的原核表达、纯化及活性鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的克隆突触小泡膜蛋白(VAMP-2)基因,原核表达、纯化并鉴定重组蛋白VAMP-2活性。方法根据GenBank中已报道的VAMP-2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从小鼠的全脑组织总RNA中获得基因。将去疏水区后的基因克隆至含有N端信号肽pelB序列的原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,并利用金属内肽酶BoNT/B轻链对该蛋白进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论成功构建pET-22b-VAMP-2表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta,Western印迹证实重组蛋白VAMP-2(残基Met 1-Met 94)获得可溶性表达。重组蛋白VAMP-2可被金属内肽酶BoNT/B特异性酶解,具有良好的生物学活性。
- 罗森王琴房华丽王德慧李崭李涛王慧
- 关键词：底物原核表达
- 硒化合物在HepG2细胞中代谢生成硒蛋白效应被引量：2
- 2015年
- 目的探讨亚硒酸钠(Na2Se O3),硒代蛋氨酸(Se Met)和甲基硒代半胱氨酸(Me Se Cys)3种硒化合物在Hep G2细胞内代谢生成硒蛋白P(SEPP)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)效应。方法将Hep G2细胞分为对照组、低、中、高剂量硒化合物组(0.01、0.10、1.00μmol/L),作用48、72 h,收集细胞上清液和裂解液;采用双抗夹心酶联免疫吸附试验检测上清中SEPP浓度与裂解液中GPx活力。结果与对照组比较,高剂量Na2Se O3、Se Met、Me Se Cys作用Hep G2细胞48 h时,上清中SEPP浓度[分别为(115.78±1.70)、(140.73±0.97)、(114.92±1.46)pg/m L]均明显升高(P<0.01),裂解液中GPx活力[分别为(490.52±5.40)、(643.26±5.40)、(603.35±6.40)U/L]明显升高(P<0.01);与Na2Se O3、Me Se Cys比较,Se Met作用效果最好(P<0.05);3种硒化合物作用Hep G2细胞48 h与72 h比较,各指标差异均无统计学意义。结论 3种硒化合物中,以Se Met作用于Hep G2细胞后代谢生成SEPP和GPx的效果最明显。
- 王琴卢佳希韩枫孙丽翠刘轶群黄振武
- 关键词：硒化合物代谢
- 硒化合物在HepG2和Hela细胞中代谢生成硒蛋白的效应比较被引量：2
- 2016年
- 目的比较亚硒酸钠(Na_2SeO_3)、硒代蛋氨酸(SeMet)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)3种硒化合物在HepG2和Hela细胞中代谢生成硒蛋白P(SEPP)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的差异。方法将培养好的细胞分为对照组、Na_2SeO_3组、SeMet组和MeSeCys组。加入0.01μmol/L和0.1μmol/L的硒化合物作用48 h和72 h,收集细胞培养上清液和裂解液。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法对上清中的SEPP和裂解液中的GPx进行定量检测。结果与对照组比较,0.1μmol/L SeMet和MeSeCys处理的Hela细胞生成的SEPP和GPx浓度显著升高(P<0.05)。与Hela细胞比较,0.1μmol/L 3种硒化合物处理的HepG2细胞生成的SEPP和GPx浓度均显著升高(P<0.05)。结论硒化合物在肝癌细胞HepG2中代谢生成硒蛋白的效应比在宫颈癌细胞Hela中更明显。
- 王琴高丽娜韩枫卢佳希刘轶群孙丽翠黄振武
- 关键词：硒化合物代谢硒蛋白HEPG2HELA细胞
- 基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法被引量：1
- 2018年
- 目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TLc)分别对目的蛋白进行酶切反应。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化。酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值。结果设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒。表达并纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白,命名为CYVAMP。利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2~32μmol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65~110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适。CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右。酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16±0.28)s-1。TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1。结论成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需。
- 罗森丁朋晓李涛王琴王慧
- 关键词：FRET肉毒毒素破伤风毒素高通量筛选
- 基于FRET构建A型肉毒毒素活性检测的高通量方法被引量：1
- 2023年
- 目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。
- 罗森郭丽娜李涛王琴王慧
- 关键词：FRET肉毒毒素
