国家自然科学基金(30872249)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
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- 维持静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化和原代培养
- 2012年
- 目的建立维持正常肝细胞静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化及原代培养方法。方法对传统小鼠肝细胞分离纯化的原位两步胶原酶灌流法进行改良,台盼蓝染色法计数细胞总数并鉴定肝细胞活率;用改良的WME培养基对C57BL/6小鼠肝细胞进行原代培养,经过碘酸雪夫氏染色(Periodic acid-Schiff stain,PAS)和全自动生化分析仪鉴定肝细胞的生物学特性及功能;Western blot法检测分离纯化后的小鼠肝细胞及原代培养24、48、72、96 h小鼠肝细胞的细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平。结果分离纯化后可从每只小鼠肝脏稳定获取(3～5)×107个肝细胞,细胞活率达(86.68±2.46)%;原代培养96 h内的小鼠肝细胞能保持合成糖原、白蛋白、尿素的功能;原代培养小鼠肝细胞中,细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平与分离纯化的小鼠肝细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05),表明原代培养96 h内的小鼠肝细胞均能维持静息细胞周期状态。结论改良的分离纯化方法能稳定获得高产量、高活率的小鼠肝细胞;改良后的原代培养方法可使肝细胞维持其特异性功能、分化特性及静息细胞周期状态。
- 罗娜蔡园张俊汤为学吴小翎何松
- 关键词：肝细胞提纯原代培养细胞周期
- HBx基因缺失突变对HBV复制和转录的影响
- 2012年
- 目的构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响。方法以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定。用SapⅠ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTMReagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中。在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录。结果在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围。两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P>0.05)。而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50%～70%(P<0.05)。结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录。
- 罗莉何松郭进军雷宇罗娜龚倩
- 关键词：HBVX蛋白CCCDNA定点突变技术
- 乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用被引量：1
- 2013年
- 目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）及其两个截短体（HBx、HBx43～154）与损伤DNA结合蛋白（DDB）1在HBV复制中的作用。方法用质粒瞬时转染HepG2细胞，72h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA，通过Westernblot分析验证DDB1蛋白表达，逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响。提取转染72h后细胞胞质DNA，收集细胞的培养上清液，通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBVDNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平，从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响。对数据进行单因素方差分析及检验。结果在有HBV复制的HepG2细胞中，缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降（相对表达水平为野生型转染组的52．74％±8．95％，f=9．143，P〈0．05），胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降（相对表达水平分别为野生型转染组的55．49％±1．19％、48．05％±2．90％、46．22％±2．20％，P值均〈0．05）。共转染HBxN-端截短体HBx4。后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平，且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平。但共转染HBxC-端截短体HBx的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降（相对表达水平为野生型转染组的59．95％±9．09％，f=7．629，P〈0．05），且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平（相对表达水平分别为野生型转染组的62．53％±0．67％、63．13％±2．14／0、55．40％±0．99％，P值均〈0．05）。并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBVDNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的。结论C-�
- 杨旋何松罗娜罗莉樊浩龚倩
- 关键词：肝炎病毒乙型乙型
