国家自然科学基金(20776051)
- 作品数：3 被引量：14H指数：3
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- 新抗菌靶点分选酶基因(srtA)在两种原核载体中的克隆表达被引量：6
- 2009年
- 【目的】革兰氏阳性菌的表面蛋白在病原菌致病性方面具有重要作用,表面蛋白锚定到细胞壁过程的关键酶—分选酶成为抗感染的新靶点。【方法】本文利用GenBank中的分选酶A基因(srtA)序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得618bp的DNA片段。按照常规分子克隆操作成功构建两种原核表达载体pet22-srtA和pTRX-srtA,转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中,在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。利用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定和分析,【结果】结果显示:(1)重组载体pet22-srtA和pTRX-srtA分别表达出相对分子量为约45kDa和39kDa的外源蛋白;【结论】(2)分子伴侣硫氧还蛋白(Trx)有利于分选酶A基因的可溶性表达。该实验为后续的分选酶酶学性质研究特别是抑制剂筛选研究奠定良好基础。
- 罗立新江彬强陈谋通
- 关键词：原核表达金黄色葡萄球菌抗菌
- 酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测被引量：4
- 2009年
- 【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构建QALPETGEE-linker-EGFP酵母表面展示载体后转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中。重组菌经培养,利用荧光显微镜检测重组酵母的荧光强度,然后通过荧光分光光度计检测分选酶与底物相互作用后产生游离的EGFP荧光强度进而确定分选酶的酶活。【结果】荧光显微镜下观察到重组酵母细胞表面有绿色荧光且强度随时间增强。荧光分光光度计检测表明,反应后上清游离的EGFP荧光强度由原先的187.67±2.16增加至273.47±2.14。【结论】这表明分选酶底物已成功展示在酵母表面,且为分选酶的活性检测提供了高效、经济的方法。
- 罗立新吴琳林影
- 关键词：荧光分光光度计底物活性检测
- 分选酶A在pET32a(+)原核表达载体中的表达和鉴定被引量：10
- 2011年
- 旨在pET32a(+)原核表达载体中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶分选酶(SrtA)并进行鉴定。以合有pET22-srtA质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增得到SrtA_(△N24)和SrtA_(△N59)基因,经过BamHⅠ、XhoⅠ酶切,克隆入表达载体pET32a(+)中,构建重组载体pET32a-SrtA_(△N24)及pET32a-SrtA_(△N59),并转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物分别进行分析和鉴定。然后对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行了优化。结果显示重组载体pET32a-SrtA_(△N24)和pET32a-SrtA_(△N59)分别表达出相对分子量为约42 kD和37 kD的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting检测显示其分子量与预期的大小相符合。成功构建了重组质粒pET32a-SrtA_(△N24)和pET32a-SrtA_(△N59),并且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达。
- 朱芳邓思罗立新
