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B淋巴细胞活化因子特异的单链DNA适体的人工进化被引量：1: 2007年; 目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor be longing to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力。方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systemati cevolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力。结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量最高达75%,分为6类不同序列;Dotblotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值最高(0.752,P<0.05),具有对BAFF相对最高结合力。结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础。; 曾贤铭仲人前周琳杨再兴梁艳蒋廷旺吴传勇; 关键词：B淋巴细胞活化因子适体单链DNA 进化

用重组丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体及其临床意义被引量：1: 2007年; 目的用重组表达的丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)检测M2抗体,以利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期诊断。方法采用重组表达的PDC-E2建立了免疫印迹法(IBT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。检测40例PBC患者血清的M2抗体,以其他肝病患者、自身免疫病患者、健康体检者作对照。结果40例PBC患者血清中检测出抗PDC-E2抗体阳性37例,阴性3例,阳性率为92.5%,而疾病对照组和健康体检者血清中该抗体检测均为阴性。结论用重组表达的人PDC-E2检测抗体有较好的敏感性和特异性,有助于PBC的临床诊断。; 陈燕姚定康周晔蒋廷旺吴传勇钱琤邓安梅仲人前; 关键词：胆汁性肝硬化自身抗体免疫印迹法酶联免疫吸附试验

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析被引量：7: 2006年; 目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定。方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性。结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性。结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础。; 钱琤陈孙孝周晔王燕谷明莉陈波陈燕邓安梅仲人前; 关键词：颗粒溶素基因表达生物学活性

自身免疫性疾病噬菌体抗体库的构建和初步鉴定被引量：1: 2009年; 目的构建系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、强直性脊柱炎、干燥综合症（SS）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）等自身免疫性疾病的噬菌体抗体库。方法从多例确诊的高滴度自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA，用RT—PCR方法分别扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因。经SacI和XbaI限制性双酶切后，在T4连接酶的作用下，将轻链基因片段克隆入同样双酶切的pComb3Hss载体中以构建轻链文库，随后将重链Fd段PCR产物经XhoI和SpeI双酶切后载入同样处理的κ/λpComb3Hss载体，然后将重组质粒κ/λ—Fd-pComb3Hss转化大肠杆菌XL1-Blue。用辅助噬菌体M13K07感染XL1-Blue，则可在噬菌体表面表达出随机的重组抗体库。结果提取的淋巴细胞总RNA及合成的cDNA质量好，PCR扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因，成功构建了库容为4×10^4的轻链抗体库和库容为6×10^4的Fab片段噬菌体抗体库，酶切及PCR鉴定均正确无误。结论成功构建了自身免疫性疾病的噬菌体抗体库，为进-步筛选出高亲和力抗体打下了基础。; 吴炜霖夏维陆慧琦熊怡淞杨再兴周琳韩焕兴仲人前; 关键词：自身免疫疾病细菌噬菌体抗体

荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平被引量：3: 2007年; 目的:通过建立荧光定量RT-PCR的方法,检测颗粒溶素(Granulysin,GNLY)mRNA在人外周血单个核细胞(PBMCs)中基因表达的水平。方法:基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-GNLY,建立荧光定量RT-PCR方法,并检测了40名正常健康献血者外周血中GNLY的表达水平。结果:内参18SrRNA的动态检测范围为103～108拷贝/μgRNA;而40名正常健康人外周血的PBMCs中均有GNLYmRNA的表达,范围为3.12×106～4.32×107拷贝/μgRNA,均值为[(2.0±1.3)×107]拷贝/μgRNA。结论:建立了人GNLY基因表达水平的荧光定量PCR检测方法,结果准确可靠,为今后进一步研究GNLYmRNA表达水平与感染性疾病免疫机制的相关性研究打下了基础。; 钱琤陈孙孝周晔陈波蒋廷旺吴传勇邓安梅仲人前; 关键词：颗粒溶素聚合酶链反应外周血单个核细胞

结核分枝杆菌抗原Rv0173的克隆、表达与纯化被引量：1: 2007年; 目的在大肠杆菌中表达、纯化结核分枝杆菌Rv0173抗原,为研制新型结核病疫苗打下基础。方法将结核杆菌抗原Rv0173的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0173重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0173重组子,Rv0173蛋白在BL21菌中获得表达,表达的蛋白条带大小约45KD,与预期结果相符。结论成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Rv0173进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础。; 蒋天舒娄加陶周晔陈燕陈波谷明莉仲人前邓安梅; 关键词：结核分支杆菌表达纯化

结核分枝杆菌抗原Ag85A(Rv3840c)限制性CD8^+ CTL表位的预测及鉴定被引量：2: 2007年; 目的预测及鉴定新的HLA-A*0201结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Ag85A中的CD8+CTL优势表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测可能存在的HLA-A*0201的限制性CD8+CTL表位,并经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力、经时间荧光分辨法检测结核(TB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应,再通过细胞毒实验研究抗原肽诱导的T细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。结果位于Ag85A氨基酸序列(48-56)的肽表位与HLA-A*0201分子具有较高的亲和力,并能刺激HLA-A*0201阳性结核患者PBMC增殖,诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽6(GLPVEYLQV,48-56aa)是Mtb抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,这为今后进一步研究结核杆菌,作为设计结核疫苗的候选表位奠定了一些基础。; 陈燕娄加陶吴传勇周晔陈波蒋天舒邓安梅仲人前; 关键词：结核分枝杆菌抗原表位细胞毒性T细胞

颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用被引量：5: 2006年; 钱陈孙孝吴传勇蒋廷旺王燕周晔陈燕陈波邓安梅仲人前; 关键词：酶联免疫吸附测定法颗粒溶素单核细胞增多症血清水平结合蛋白

B细胞激活因子受体家族基因表达与原发性胆汁性肝硬化相关性研究被引量：1: 2007年; 目的探讨 B 细胞激活因子(BAFF)受体家族基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法以18S rRNA 为内参基因,通过靶基因与内参基因循环阈值之差,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)相对定量方法,检测30例正常人和30例 PBC 患者外周血单个核细胞 B 细胞成熟抗原(BCMA),穿膜蛋白活化物(TACI)及 B 细胞激活因子受体(BAFF-R)基因的相对表达量,并分析其与免疫球蛋白 IgM、碱性磷酸酶(ALP)及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的相关性。结果 PBC 患者外周血单个核细胞 BCMA mRNA 是正常对照组的8.6倍,差异有统计学意义(P<0.05);TACI mRNA 显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而 BAFF-R mRNA 比正常对照组稍降低,差异无统计学意义(P>0.05)。BCMA 的△Ct 值与 IgM、GGT 和 ALP 有相关性(P<0.01);TACI 的△Ct 值与 IgM 有相关性(P<0.05),与 GGT、ALP 无相关性(均 P>0.05);BAFF-R 与IgM、GGT 和 ALP 均无相关性(均 P>0.05)。结论 PBC 患者外周血单个核细胞 BCMA mRNA 表达水平显著升高,TACI 基因表达明显降低,提示 PBC 发病机制与体液免疫增强、免疫耐受打破有关,且BCMA 可能与 PBC 的疾病进程有关。; 梁艳杨再兴朱烨王燕曾贤铭邓安梅仲人前; 关键词：胆汁性肝硬化聚合酶链反应

人源化抗体的演进发展及应用现状被引量：2: 2009年; 抗体的制备在经历了多克隆抗体、单克隆抗体后,进入了以人源化为目标的基因工程抗体阶段。嵌合抗体(chime ricantibody)属于第一代人源化抗体,是应用DNA重组技术将鼠源性的可变区(V区)基因与人抗体的恒定区(C区)基因相连接构成嵌合基因的表达产物。在此基础上产生的第二代人源化抗体,即CDR移植抗体(CDR-grafted antibody),仅保留了3个CDR是鼠源性的,人源性可达90%以上。以上两者仍保留了鼠源性的成分,可诱发人抗鼠抗体(HAMA)反应。20世纪90年代以后产生的噬菌体抗体库技术,融合了噬菌体展示和抗体组合文库技术,突出了基因型与表型的统一,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段,全人源化抗体的生产和应用逐渐走向成熟。人源化抗体在肿瘤、器官移植排斥反应、自身免疫病等疾病的临床诊断和治疗中显示出了广阔的应用前景。; 吴炜霖仲人前; 关键词：人源化抗体噬菌体展示技术

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