国家自然科学基金(30070563)
- 作品数：23 被引量：122H指数：6
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 猪肌生成抑制素在COS-7细胞中的表达及检测
- 2005年
- 本研究室构建的猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,转染到COS-7细胞中,使猪MSTN成熟蛋白编码序列全长358个氨基酸在COS-7细胞中进行表达,利用Trizol试剂提取转染细胞的总RNA,借助RT-PCR和SDS-PAGE电泳方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了猪MSTN在COS-7细胞中的表达,并应用Western-blotting方法证实了猪MSTN表达的特异性。
- 吕文发逄大欣欧阳红生
- 关键词：肌生成抑制素真核表达COS-7细胞
- 猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆被引量：1
- 2003年
- 将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段,F_1、F_2、F_3、R_6、R_5、R_4、F_4、F_5、F_6、R_3、R_2和R_1,采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F_1长38bp,R_1长36bp,其他片段均40bp长,F_1和R_1片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段。该片段与pMDI8-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。
- 吕文发赵静欧阳红生
- 关键词：基因合成基因克隆负调控因子
- 猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化
- 2004年
- 猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA去除信号肽后对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1 2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27 9%,表达的MSTN分子量为41451 3D.因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,则用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92 5%.该试验为获得较好的猪肌生成抑制素基因抗原、制备抗体打下了良好的基础。
- 张锐孙美榕欧阳红生张玉静
- 猪肌生成抑制素基因编码序列的分析被引量：8
- 2000年
- 通过PCR分段扩增出军牧 1号白猪的肌生成抑制素基因编码序列 112 8bp ,与国外猪种同一基因的cDNA序列进行比较 ,仅在 634bp处发生了由T替换C的变化 ,但对应的氨基酸没有变化。
- 孙博兴侯万文欧阳红生李慎涛郭淑艳
- 关键词：PCRDNA序列分析
- 诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建及鉴定被引量：2
- 2009年
- 通过PCR方法分别从pGL3-Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA;利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGCFRT2NeoR上用XholⅠ和SalⅠ酶切得到FRT2NeoR盒子。将上述4个片段利用SOE-PCR及T4DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体pET28a(+)构建Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。用LipofectamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,G418筛选阳性细胞,PCR鉴定。结果表明,成功构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,并成功整合到猪成纤维细胞的基因组中,获得了诱导性表达Cre重组酶的转基因猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得诱导性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。
- 陈立梅逄大欣李莉李占军杨春聂代邦欧阳红生
- 关键词：CRE重组酶原核表达载体SOE-PCR
- 猪肌生成抑制素组织分布研究被引量：8
- 2004年
- 利用经纯化、偶联后的猪肌生成抑制素包涵体获得的高效价猪肌生成抑制素 (MSTN)抗血清进行免疫组织化学实验 ,结果表明 :MSTN在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪细胞中呈现重度染色 ,说明MSTN在这些组织细胞中均有分布。而在肌肉、肾脏、子宫细胞中出现轻微染色 ,这说明MSTN在这些组织细胞中分布较弱 (2 0 0倍光镜 ) 。
- 吕文发赵静欧阳红生梁冠生王恒
- 关键词：畜牧学免疫组织化学
- 猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备被引量：11
- 2003年
- 用IPTG诱导pET 28α MSTN BL21工程菌产生猪肌生成抑制素下游包涵体,应用SDS-PAGE侧带法纯化包涵体蛋白,并用EDCI进行直接偶联,皮下多点注射试验用獭兔,连续免疫3次,每次间隔2周,其间用ELISA跟踪检测抗体效价。6周后,心脏采血,获得高效价的抗血清,血清滴度达1∶6400。
- 吕文发赵静卢广林欧阳红生
- 关键词：MSTN骨骼肌偶联
- 真核基因在pET系统中表达出现的问题与拟解决的方案被引量：33
- 2004年
- pET表达系统是以噬菌体的T7为启动子 ,可以从各种基因 (包括原核、真核细胞 )生产大量的目的蛋白[1 ] ,然而一些真核基因在pET表达系统中的蛋白表达量却很少 ,有许多因素影响真核基因在该表达系统中的表达 ,如信号肽序列、毒性基因与质粒的稳定性、mRNA转录的二级结构和稀有密码子 ,以及实际操作过程中表达条件等均会影响真核基因在pET系统中的表达。该文旨在分析其主要原因 ,并提出拟解决的方案 ,以达到满意的高效表达。
- 张锐孙美榕欧阳红生张玉静
- 关键词：真核基因原核表达系统噬菌体启动子
- 猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA的克隆被引量：14
- 2001年
- 从猪的肌生成抑制素 ( MSTN)编码序列中设计引物 ,以军牧一号猪肌细胞总 RNA为模板 ,利用 RT-PCR和嵌套 PCR技术 ,扩增出 MSTN c DNA片段。该片段全长 1 2 77bp,包含猪 MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与 p MD1 8-T载体连接 ,转化到 JM1 0 9大肠杆菌中 ,成功地筛选到阳性克隆 ,其质粒测序结果与文献报道的一致。经 Eco R 和 Pst 酶解分析 ,c DNA片段与 p MD1 8-T载体之间既有正向插入的克隆 ,也有反向插入的克隆 ,所得到的 MSTN c
- 李慎涛孙博兴欧阳红生张玉静廖晓萍张锐张永亮吴文甲
- 关键词：肌生成抑制素基因克隆
- 猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中的表达被引量：3
- 2005年
- 将猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达质粒,采用脂质体法转染COS-7细胞,经RT-PCR检测,转染重组质粒的COS-7细胞MSTN mRNA呈阳性,表明该重组体能够在真核细胞中完成转录过程。SDS-PAGE电泳结果有43 ku目的蛋白表达带,并用Western blotting证实了其表达的特异性,表明猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列可以在真核细胞中表达。
- 李树伟欧阳红生吕文发李莉张永亮李莲军
- 关键词：肌生成抑制素真核表达COS-7细胞
