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pEGFP-N1-heNOS重组质粒的构建与鉴定被引量：2: 2007年; 目的:构建pEGFP-N1-heNOS真核表达重组质粒。方法:应用基因重组手段,根据人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)基因序列和表达载体pEGFP-N1质粒上的多克隆位点设计了1对引物,对含有heNOS基因的质粒pBluescript Ⅱ SK-heNOS进行了PCR扩增,得到了约3.6kbp的目的片段。将其插入到载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因融合,重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。结果:用PCR方法成功从质粒pBluescriptⅡSK-heNOS中扩增出heNOS基因片段,经菌液PCR、酶切及测序鉴定,heNOS基因成功插入到载体pEGFP-N1质粒中,插入目的基因的真核表达载体的酶切图谱与预期一致,并且heNOS基因与Genbank所提供的序列完全一致。结论:成功构建了pEGFP-N1-heNOS真核表达重组质粒。; 王国栋郭连瑞谷涌泉李建新汪忠镐张建; 关键词：绿色荧光蛋白真核表达质粒基因重组

不同途径移植骨髓单个核细胞治疗大鼠后肢缺血被引量：44: 2005年; 目的:探讨局部肌肉注射和动脉腔内注射两种途径进行骨髓单个核细胞移植治疗大鼠后肢缺血的效果。方法:实验于2004-02/06在首都医科大学宣武医院动物室完成。通过切除股浅动脉及其分支血管制作Lewis大鼠单侧后肢缺血模型,7d后进行骨髓单个核细胞移植。骨髓单个核细胞取自同系健康大鼠的四肢长骨,用密度梯度离心法获得。26只Lewis大鼠随机分成局部肌肉注射细胞移植组(实验组Ⅰ,n=8)和局部肌肉注射无血清IMDM培养基组(对照组Ⅰ,n=5);动脉腔内注射细胞移植组(实验组Ⅱ,n=8)和腔内注射无血清IMDM培养基组(对照组Ⅱ,n=5)。实验组每只大鼠移植5×106骨髓单个核细胞。在移植后4周测定双侧后肢皮肤温度差、激光多普勒血流仪测定皮肤灌注量,免疫组化染色计数毛细血管数量,数字减影血管造影(digitalsubtractionangiography,DSA)观察血管新生情况作为评价指标,研究两种移植途径对下肢缺血的不同治疗作用。结果:所有大鼠未出现后肢坏疽。移植后4周双侧后肢皮肤温度差实验组Ⅰ为0.90±0.17,对照组Ⅰ为2.54±0.14;实验组Ⅱ为1.01±0.22,对照组Ⅱ为2.84±0.25,实验组较对照组明显低(P<0.05)。激光多普勒血流测定显示双侧后肢皮肤灌注量之差实验组Ⅰ为18.0±5.6,对照组Ⅰ为32.1±9.4;实验组II为21.8±7.1,对照组Ⅱ为28.6?; 郭连瑞谷涌泉张建张淑文吴英锋崔叶青郭德玉汪忠镐; 关键词：骨髓细胞缺血

犬骨髓源血管内皮祖细胞体外扩增效能的动态研究被引量：15: 2005年; 目的:应用离体培养法培养骨髓来源的血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)并动态观察扩增效能。方法:2004-04/12在首都医科大学宣武医院外科实验室完成。使用条件培养基和纤维连接蛋白培养骨髓单个核细胞,相差显微镜观察形态变化,测量生长曲线观察增殖能力,检测摄取Dil-ac-LDL的功能,不同时间点行flk-1,CD133和Ⅷ因子的免疫细胞化学检测和CD34,VEG-FR-2及CD133的流式细胞仪检测以定性并观察扩增效率。结果:集落样生长的贴壁细胞平均10d汇合,每毫升骨髓可获得大约(1.3±0.3)×106个细胞,外观鹅卵石样,能摄取Dil-ac-LDL,flk-1,CD133和Ⅷ因子,免疫细胞化学染色均呈阳性,流式细胞仪示VEGFR-2和CD133双阳性细胞扩增达33倍。结论:离体扩增培养法可成功地从骨髓中扩增EPCs,扩增效率能够满足组织工程血管对种子细胞的需要,也为骨髓单个核细胞移植治疗组织缺血提供了间接证据。; 吴英锋谷涌泉张建郭连瑞陈兵罗涛孙雪静崔叶青吴燕川万岁桂李建新汪忠镐; 关键词：内皮血管骨髓细胞

骨髓刺激对大鼠骨髓源内皮祖细胞的影响被引量：1: 2008年; 目的观察大鼠骨髓刺激后骨髓源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的改变,探讨采用骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的可能机制。方法取12只SPF级雄性Lewis大鼠,体重200～250g,按是否皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子注射液分为刺激组和对照组(n=6)。取骨髓单个核细胞用EBM-2培养液进行诱导分化,培养7d后对贴壁细胞采用异硫氰酸荧光素-荆豆凝血素1和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白染色进行EPCs鉴定及计数;同时采用黏附能力测定实验观察EPCs的黏附能力。另取12只SPF级雄性Lewis大鼠制备单侧后肢缺血模型,在模型制备后3d将8×106个EPCs移植至缺血侧后肢的肌肉内,按照移植EPCs来源不同将后肢缺血大鼠分为刺激组和对照组(n=6)。EPCs移植3周后行后肢血管造影,计算缺血侧后肢侧支血管数目。结果大鼠骨髓单个核细胞培养7d后刺激组EPCs数量为(145.2±37.0)个/HP,大于对照组(95.2±39.4)个/HP(P<0.05);刺激组黏附EPCs数量为(21.8±4.3)个/HP,大于对照组(15.0±5.2)个/HP(P<0.05)。大鼠骨髓源EPCs移植至缺血肢体后3周,刺激组EPCs移植后缺血侧后肢侧支血管数目为(4.2±1.2)个,大于对照组的(2.7±0.8)个(P<0.05)。结论骨髓刺激使骨髓源EPCs数量增加、功能改善,可能是骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的机制之一。; 佟铸谷涌泉张建李建新张淑文汪忠镐; 关键词：重组人粒细胞集落刺激因子内皮祖细胞细胞移植

原发性下肢深静脉瓣膜功能不全误诊17例分析与治疗被引量：4: 2012年; 目的:探讨避免原发性下肢深静脉瓣膜功能不全误诊的方法,观察医用弹力袜在治疗该病中的疗效。方法:分析17例在外院误诊后笔者进一步诊治的原发性下肢深静脉瓣膜功不全的临床资料。对该组患者采用以应用医用弹力袜为主的治疗。结果:经平均16.1个月的随访,25%的患者症状全部消失,50%的患者症状明显缓解,16.7%的患者症状缓解,8.3%的患者症状无缓解。结论:加强对患者临床表现的鉴别、规范的下肢静脉彩色多普勒超声和下肢深静脉造影检查有助于减少误诊;医用弹力袜对于原发性下肢深静脉瓣膜功能不全具有一定的疗效。; 佟铸谷涌泉李学锋郭连瑞郭建明汪忠镐李建新张建; 关键词：深静脉下肢误诊医用弹力袜

不同氧浓度对骨髓源内皮祖细胞分泌促血管新生相关生长因子的影响被引量：2: 2018年; 目的:观察培养环境不同氧浓度对骨髓源内皮祖细胞分泌促血管新生相关生长因子的影响。方法:利用密度梯度离心技术分离SD大鼠骨髓单个核细胞,向内皮祖细胞进行诱导分化、扩增、培养和鉴定。然后在不同氧浓度(1%,5%,21%)的环境中培养,于第3天,7天,10天采用酶联免疫吸附试验检测内皮祖细胞分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质细胞衍生因子-1α(Stromal-derived factor-1α, SDF-1α)、胰岛素样生长因子I(Insulin-like growth factor-I, IGF-I)等生长因子的水平。结果:第3天,不同氧浓度下各组EPC分泌VEGF、SDF-1α、IGF-I无明显差异(P均>0.05)。第7天和第10天,各组EPC分泌IGF-I无明显差异(P均>0.05);但是和21%氧浓度相比,相对低氧浓度(1%和5%)能够明显增强EPC分泌VEGF和SDF-1α(P均<0.001)。结论:适当时间的低氧环境培养能够显著刺激内皮祖细胞分泌VEGF和SDF-1α,进而增强其促血管新生能力。; 宋礼坡张建谷涌泉郭连瑞王春梅吴英锋崔世军佟铸汪忠镐; 关键词：氧浓度骨髓干细胞内皮祖细胞

重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建被引量：1: 2006年; 目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据。方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成。用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增。将人内皮一氧化氮合酶与pMD18-Tsimple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序。结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3kb及3.7kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确。加入上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功。②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD18-Tsimple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7kb和2.7kb处各出现一条条带,证明两者连接成功。③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7kb和3.7kb处各出现一条条带,证明连接正确。④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功。结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础。; 廖传军郭连瑞李建新谷涌泉俞恒锡汪忠镐张建; 关键词：发光蛋白质类质粒

重组人pEGFP-heNOS质粒的构建及其在人内皮祖细胞中的表达被引量：4: 2006年; 目的构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因(EGFP)的人内皮一氧化氮合酶(heNOS)重组质粒,观察其在人骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)中的表达。方法构建重组人pEGFP-heNOS质粒,脂质体转染人骨髓来源的内皮祖细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测heNOS在内皮祖细胞中的表达。结果重组人pEGFP-heNOS质粒构建成功,体外转染人人内皮祖细胞中,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测到heNOS的表达。结论重组人pEGFP-heNOS质粒体外转染人内皮祖细胞后,目的基因能够在细胞中有效表达,为下一步基因治疗提供了理论支持。; 廖传军郭秒郭连瑞李建新谷涌泉俞恒锡汪忠镐张建; 关键词：一氧化氮合酶绿色荧光蛋白基因转染内皮细胞

eNOS基因治疗促进大鼠缺血后肢的血管新生被引量：2: 2018年; 目的:评估内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因治疗对大鼠缺血后肢血管新生的影响。方法:局麻下将30只雄性SD大鼠后肢缺血模型制作后,随机分成实验组和对照组,每组15只。模型制作后1周,采用肌肉注射的方法,实验组缺血后肢接受载有eNOS基因的5型重组腺病毒治疗,对照组接受生理盐水治疗。eNOS基因治疗后4周,评估SD大鼠踝部动脉压、微循环灌注、数字减影血管造影、组织微血管计数以及eNOS蛋白的表达。结果:eNOS基因治疗后4周,和对照组相比,接受eNOS基因治疗的大鼠缺血肢体,表现了更好的血流恢复(踝部动脉压(mmHg):58.2±4.7 vs 86.8±4.3,P<0.01;微循环灌注:142.0%±21.5%vs 219.6%±26.2%,P<0.01)、侧枝开放和血管新生(血管造影:6.7±1.1 vs 14.4±1.7,P<0.01;微血管/肌纤维比值:0.34±0.03 vs 0.56±0.02,P<0.01)以及eNOS蛋白的高表达(0.46±0.02 vs 0.73±0.02,P<0.01)。结论:eNOS基因治疗促进SD大鼠缺血后肢的血管新生。; 宋礼坡郭连瑞张建谷涌泉王春梅吴英锋罗涛崔世军李建新汪忠镐; 关键词：内皮型一氧化氮合酶基因治疗严重肢体缺血血管新生

内皮型一氧化氮合酶基因转染犬骨髓源内皮祖细胞的实验研究: 2009年; 目的:探讨人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)基因转染犬内皮祖细胞(EPCs)的有效方法。方法:分别用5型腺病毒和pEGFP-N1质粒作为载体携带heNOS,对体外定向培养扩增的骨髓来源的犬EPCs进行体外转染,然后对转染heNOS基因后的EPCs进行鉴定及功能检测,观察heNOS基因的功能表达情况。结果:heNOS转染犬EPCs48h后,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测到5型腺病毒转染组EPCs的eNOS表达量(2091.67±172.49pg/ml)较pEGFP-N1质粒转染组(173.67±36.76pg/ml)和未转染组(158.00±30.91pg/ml)均显著增多(P<0.01);硝酸还原酶法测定5型腺病毒转染组细胞培养上清中的NO含量(49.5±5.2μmol/L)较质粒转染组(38.5±7.1μmol/L)和未转染组(39.7±7.2μmol/L)均显著增多(P<0.01)。结论:5型腺病毒载体介导的heNOS基因能够成功地转染犬EPCs,并能在EPCs中有效表达。; 郭连瑞王国栋宋礼坡谷涌泉张淑文李建新汪忠镐张建; 关键词：内皮祖细胞内皮一氧化氮合酶腺病毒转染

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