江苏省社会发展科技计划(BS2005029)
- 作品数：8 被引量：11H指数：2
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- 相关机构：南通大学南通市第三人民医院复旦大学更多>>
- 发文基金：江苏省社会发展科技计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 增殖诱导配体基因与消化系肿瘤
- 2008年
- 增殖诱导配体(aproliferation-inducing ligand,APRIL)基因是近年发现的肿瘤坏死因子超家族的新成员,研究发现APRIL基因在多种肿瘤组织,特别是消化道肿瘤中高表达,提示APRIL基因在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。对APRIL基因的深入研究将有助于进一步认识消化系肿瘤的本质,并为肿瘤的诊断和治疗提供新途径。
- 王峰邵建国
- 关键词：消化系统肿瘤细胞增殖
- 靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化被引量：1
- 2007年
- 目的:制备及纯化针对增殖诱导配体基因(APRIL)的小干扰RNA(APRIL siRNA),为进一步研究APRIL基因在人胰腺癌中的作用奠定基础。方法:构建靶向胰腺癌CFPAC-1细胞株APRIL基因双链RNA(APRIL dsRNA)的表达质粒pET-22b-APRIL,在大肠杆菌中发酵表达APRIL dsRNA,并利用CF-11树脂亲和层析纯化;用大肠杆菌Ⅲ型RNA水解酶(RNaseⅢ)水解dsRNA,制备APRIL siRNA,应用DEAE树脂离子交换层析使RNaseⅢ与核苷酸分离,分子筛层析进一步分离纯化APRIL siRNA。将纯化后的APRIL siRNA转染CHO细胞,荧光显微镜下观察转染后CHO细胞APRIL蛋白的表达情况。结果:pET-22b-APRIL转染大肠杆菌后,经IPTG诱导能大量表达APRIL dsRNA,表达产物经CF-11树脂纯化能得到纯化的APRIL dsRNA;dsRNA经RNaseⅢ水解后,过DEAE树脂离子交换层析柱,经5%PAGE、12%SDS-PAGE电泳证实RNaseⅢ与核苷酸分离,进一步经分子筛层析分离纯化,得到纯化APRIL siRNA。荧光显微镜下观察结果表明,APRIL siR- NA转染CHO细胞能明显抑制APRIL蛋白的表达。结论:成功制备了靶向CFPAC-1细胞株的APRIL siRNA,为下一步敲减CFPAC-1细胞APRIL基因的研究奠定了基础。
- 毛振彪邵建国王唯一谭畅黄伟达黄介飞
- 关键词：增殖诱导配体RNA干扰胰腺肿瘤
- RNAi技术在胰腺癌中的应用
- 2007年
- RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程,是一种高效、高特异性的抑制基因表达的新途径。现将RNAi技术的作用机制及RNAi在胰腺癌中的应用作一综述。
- 陈琳邵建国
- 关键词：RNA干扰胰腺癌基因治疗
- 消化系肿瘤增殖诱导配体高表达细胞株的筛选被引量：6
- 2006年
- 目的筛选出增殖诱导配体(APRIL)mRNA高水平表达的人消化系肿瘤细胞株,为进一步探讨APRIL基因在消化系统肿瘤发生、发展以及转移过程中的作用机制奠定基础。方法选择2株人胃癌细胞(AGS、SGC7901)和3株人胰腺癌细胞(PANC1、CFPAC-1、BxPC3)培养提取mRNA后,逆转录成cDNA作PCR模板。以APRIL基因高保守区设计特异性的引物,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参,PCR扩增目的片段,通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRILmRNA的表达量,以表达量最高的1株作为1,获得各细胞株的APRILmRNA表达量的相对值。结果5株细胞APRILmRNA的相对值分别为:AGS,0.09;SGC7901,0.61;PANC1,0.45;CFPAC1,1;BxPC3,0.57,按表达量高低顺序为:CFPAC1>SGC7901>BxPC3>PANC1>AGS。结论在不同肿瘤细胞中APRIL的表达有高有低,提示APRIL基因在肿瘤发生、发展过程中起一定作用。
- 邵建国毛振彪谭畅黄介飞王唯一黄伟达
- 关键词：消化系统肿瘤聚合酶链反应配体
- 慢病毒绿色荧光蛋白感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率观察被引量：1
- 2008年
- 目的:观察慢病毒-绿色荧光蛋白(Lentivirus-green fluorescent proteins,慢病毒-GFP)感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率,为后继的利用慢病毒载体来介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)实验作准备。方法:应用慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞,在感染后不同的时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况并计算感染效率。结果:慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞从60～72小时开始可见明显的绿色荧光,在感染复数(multiplicity of infection,MOI)=10时,CFPAC-1细胞的慢病毒感染效率在60小时左右可达80%以上,72小时～7天基本能够达到90%的感染效率,在此后4周内作连续观察,感染效率仍维持在80%～90%。结论:慢病毒可稳定感染人胰腺癌细胞株CF-PAC-1,且效率高,可作为载体对该细胞株进行RNAi实验。
- 王峰陈琳邵建国
- 关键词：慢病毒胰腺癌细胞CFPAC-1绿色荧光蛋白
- 胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建被引量：2
- 2008年
- 目的构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体（a proliferation—inducing ligand，APRIL）基因的shRNA慢病毒表达载体。方法应用基因工程技术，筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列，与pGCL—GFP载体连接，构建慢病毒表达载体LV—shAPRIL；将连接产物转化到DH5a感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。再用LV—shAPRIL、pHelper1．0、pHdper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒。重组慢病毒感染CFPAC1细胞，实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达。结果PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致，经包装产生的病毒滴度为5×10^7Tu／ml。构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周，APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73％、70％和71％；APRIL蛋白表达量分别下降了66％、63％和62％（P〈0．05）。而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异（P〉0．05）。结论成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV—shAPRIL。
- 陈琳王峰邵建国毛振彪
- 关键词：RNA干扰慢病毒属增殖诱导配体细胞系
- 增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建被引量：1
- 2008年
- 目的构建针对人的增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）基因的短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）慢病毒表达载体，并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数（multiplicity of infection，MOI）值。方法以人APRIL基因为靶点，筛选出3条shRNA靶序列：shAPRILl210、shAPRILl754、shAPRILl604；各自合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGCL-GFP载体连接，构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604；将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞，经PCR及DNA测序鉴定。再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值。结果PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604的预期结果一致，经包装产生的慢病毒滴度分别为5×10^7、6×10^7、4×10^7转导单位（TU）／ml；适合高效感染的MOI值为5。结论成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL，为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础。
- 王峰陈琳邵建国毛振彪
- 关键词：慢病毒属膜蛋白质类肿瘤坏死因子类小分子干扰
- 慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达被引量：2
- 2008年
- 目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducingligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础。方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRILshRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将LV-APRIL shRNA、pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较。结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107TU/ml。感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P<0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P<0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异。结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRIL shRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达。
- 王峰陈琳邵建国毛振彪
- 关键词：增殖诱导配体RNA干扰慢病毒胰腺癌
