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腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响被引量：2: 2015年; 目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p Ad-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒。Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。结论成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础。; 代安亚王方冯文莉; 关键词：凋亡诱导因子细胞凋亡腺病毒载体 K562细胞

FKBP-RAP-FRB系统转运BCR-ABL入核对K562细胞的增殖抑制效应被引量：1: 2014年; BCR-ABL融合蛋白是慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病的基础。其中,BCR-ABL只能定位于细胞浆、不能易位至细胞核是其致病的关键因素。因此,转运BCRABL入核可能是治疗CML的潜在方法。该研究利用基因重组技术,构建HA-2FKBP-ABD(HF2A)和FLAG-3NLS-FRB*(FN3R)重组腺病毒,与雷帕霉素类似物(Rapamycin analog)一同组成FKBP-RAPFRB系统,转运K562细胞胞浆中的BCR-ABL癌蛋白至细胞核,并探究其对K562细胞增殖的影响。结果显示,成功构建了高滴度的重组腺病毒,Western blot证实目的蛋白在K562细胞内成功表达。FKBP-RAP-FRB系统可通过转运BCR-ABL入核,抑制K562细胞生长和克隆形成的能力。结果揭示,FKBP-RAP-FRB系统转运BCR-ABL入核有望为CML提供新的治疗手段。; 高淼黄峥兰曹唯希李千音李会冯文莉; 关键词：慢性粒细胞白血病 BCR-ABL K562细胞重组腺病毒

重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定被引量：3: 2012年; 目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。; 李千音黄峥兰高淼钟梁冯文莉; 关键词：SH2 FKBP 重组腺病毒

重组腺病毒Ad5/F35-HF2S在白血病K562细胞的定位及与Bcr-Abl的相互作用: 2013年; 目的:研究重组腺病毒载体Ad5/F35-HF2S在慢性粒细胞白血病K562细胞中的定位及与融合蛋白BcrAbl的相互作用。方法:将Ad5/F35-HF2S腺病毒载体感染K562细胞,然后RT-PCR和蛋白质印迹法鉴定其表达情况,采用免疫荧光和蛋白质印迹法鉴定融合蛋白HF2S在K562细胞中的定位,免疫荧光法检测HF2S与Bcr-Abl在细胞质中的共定位情况,免疫共沉淀技术验证二者之间是否存在相互作用。结果:重组腺病毒Ad5/F35-HF2S能高效感染白血病K562细胞,并进行了正确表达。重组蛋白HF2S与Bcr-Abl共定位于细胞质,并能相互结合。结论:在K562细胞质中成功表达能与Bcr-Abl相互作用的HF2S蛋白,为后续靶向转运Bcr-Abl入核并治疗慢性粒细胞白血病奠定了基础。; 李千音黄峥兰高淼李会钟梁冯文莉; 关键词：白血病 BCR-ABL阳性融合蛋白质类 BCR-ABL

HA-2FKBP-ABD融合蛋白的原核表达及与BCR-ABL的相互作用被引量：1: 2013年; 目的构建经原核表达和纯化的HA-2FKBP-ABD(HF2A)融合蛋白,探讨HF2A对BCR-ABL的靶向作用。方法用PCR扩增HF2A片段,将HF2A克隆入pET32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化HF2A蛋白,SDS-PAGE分析诱导和纯化的条件,western blot鉴定HF2A蛋白的表达,pull down实验检测HF2A与BCR-ABL的相互作用。结果重组原核表达载体经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;0.1 mmol/L IPTG 25℃诱导4 h获得HF2A蛋白的高表达,其分子量(Mr)约为74 000,纯化后可获得高纯度的HF2A蛋白;HF2A与BCR-ABL能相互作用。结论成功表达并纯化了HF2A融合蛋白,HF2A能够靶向作用BCR-ABL。; 高淼黄峥兰李千音李会钟梁冯文莉; 关键词：原核表达蛋白质纯化 BCR-ABL 慢性粒细胞白血病

嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB的构建与鉴定被引量：3: 2012年; 目的构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达。方法将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增。采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度;RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达。结果腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中;在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013GTU/ml;嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达。结论成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白。; 高淼黄峥兰李千音钟梁冯文莉; 关键词：同源重组核定位信号

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国家自然科学基金(81070421)