南京军区医药卫生基金(07M023)
- 作品数：7 被引量：44H指数：5
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- 骨髓间充质干细胞干预对缺血再灌注致小鼠肾小管上皮细胞损伤的保护作用被引量：8
- 2011年
- 目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）干预对缺血再灌注（I／R）诱导的急性肾损伤小鼠肾小管上皮细胞（RTECs）自身修复的影响。方法Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化出C57BL／6小鼠的骨髓间充质干细胞（mMSCs），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记。雄性C57BIM6小鼠45只，分为正常对照组（15只）、I／R组（15只、夹闭双侧肾蒂30min开放）、I／R＋BrdU—mMSCs组（15只、夹闭双侧肾蒂30min开放的同时尾静脉注射BrdU标记的mMSCs）。留取动脉血及肾组织，检测血尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）水平，制作肾组织切片行苏木素-伊红（HE）染色，荧光组织化学观察mMSCs在受体小鼠肾组织的分布，免疫组织化学观察RTECs增强细胞核抗原（PCNA）的表达，TUNEL法检测RTECs凋亡，Westernblot检测建模后第2天肾小管组织中Caspase-3、bcl-2蛋白的表达。结果BrdU标记mMSCs的阳性率可达（98．71±0．32）％。I／R＋BrdU—mMSCs组小鼠的BUN及Scr水平较I／R组为低，肾小管损伤病理明显减轻，且小鼠的肾脏中可检测到BrdU’细胞的分布。mMSCs干预后，RTECs细胞核PCNA阳性表达明显增多（P〈0．05或P〈0．01），而细胞凋亡的水平却较I／R组明显减少（P〈0．05或P〈0．01）。Westernblot进一步显示：I／R＋BrdU—mMSCs组小鼠的肾组织中Caspase-3蛋白水平明显下降[（1．16±0．33）比（1．64±0．27），P〈0．01]，而bcl-2水平却明显增高[（O．944-0．27）比（O．684-0．15），P〈0．01]。结论小鼠发生I／R诱导的急性肾损伤后可诱导移植的MSCs向损伤肾组织归巢，锚定在肾脏的MSCs可促进损伤RTECs的再生，抑制其凋亡，从而有助于RTECs的自身修复，延缓肾损害进展。
- 刘楠梅田军程劲胡大勇张金元
- 关键词：骨髓间充质干细胞缺血再灌注肾小管上皮细胞
- 骨髓间充质干细胞干预对缺血再灌注诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响被引量：4
- 2010年
- 目的:观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)对缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导的急性肾损伤模型小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)凋亡的保护作用及机制。方法:Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法有效分离出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞(mMSCs)。雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常对照组(15只)、I/R组(15只、夹闭双侧肾蒂30min开放)、I/R+mMSCs组(15只、夹闭双侧肾蒂30min开放的同时尾静脉注射mMSCs)。造模并干预后,于1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠,留取动脉血及肾组织,检测血尿素氮(BUN)及肌酐(Scr),制作肾组织切片行HE染色进行肾小管损伤程度评分,TUNEL法检测RTECs的凋亡,Western Blot法检测建模后第2天肾小管组织中Caspase-3、Bcl-2蛋白水平的表达。结果:I/R后小鼠的BUN及Scr均显著高于正常对照组,但同一时间点I/R+mMSCs组小鼠的BUN及Scr水平较I/R组为低,以术后第7天差异最为显著(P<0.01),肾小管损伤程度评分也有着显著降低。TUNEL检测表明I/R可诱导RTECs发生明显的凋亡,以术后第2天凋亡指数(apoptosis index,AI)最高(46.71±11.20)(P<0.01),而mMSCs干预可显著降低各时间点RTECs的凋亡水平(P<0.05或P<0.01),至14d时AI基本恢复至对照组水平。Western blot进一步显示:I/R+mMSCs组小鼠的肾组织中Caspase-3蛋白水平明显下降(1.16±0.33,P<0.01),而Bcl-2水平却有明显增高(0.94±0.27,P<0.01)。结论:移植的MSCs对I/R诱导的肾损害小鼠RTECs凋亡具有抑制作用,从而有利于肾小管损伤的早期恢复,其保护机制可能与抑制Caspase-3表达,上调Bcl-2表达有关,但其细胞学和分子机制还有待进一步研究。
- 刘楠梅田军王巍巍程劲胡大勇张金元
- 关键词：急性肾损伤骨髓间充质干细胞缺血再灌注肾小管上皮细胞
- 促红细胞生成素对急性肾损伤微环境下骨髓间充质干细胞分化及分泌功能的影响被引量：5
- 2012年
- 目的观察经促红细胞生成素（EPO）干预后，体外模拟急性肾损伤（AKI）微环境下培养骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的分化及分泌功能变化。方法Percoll密度梯度离心联合贴壁培养法分离C57BL／6小鼠BM-MSC（mBM-MSC）。构建缺血再灌注（I／R）诱导AKI小鼠模型，制作健康小鼠及I／R小鼠肾脏匀浆上清。取扩增3代的mBM-MSC分组培养：A组：含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液培养；B组：健康小鼠肾脏匀浆上清干预；C组：I／R小鼠肾脏匀浆上清干预，体外模拟AKI微环境；D组：I／R小鼠肾脏匀浆上清＋不同浓度EPO（1、5、10、50U／m1）干预；培养1、3、5、7d。倒置显微镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测细胞角蛋白18（CKl8），酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中骨形态发生蛋白7（BMP-7）、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）水平。结果分离获得的P3一mBM-MSC高表达CD29和CIM4，低表达CD34和CIM5。与A、B组长梭形细胞相比，C组部分细胞出现椭圆形、短梭形、圆形外观，EPO干预可使细胞呈现鹅卵石样外观，且C、D组细胞的胞质内细胞器丰富，并可见微绒毛及桥粒。A、B组mBM-MSC内仅有极微量CKl8表达，C、D组CKl8阳性表达率显著高于A、B组（均P〈0．01），50U／mlEPO干预5、7d后CKl8表达量显著高于同时间点C组（5d：35．22±4．04比8．72±0．38，7d：42．00±5．39比13．20±1．14，均P〈0．01）。A、B组上清液中均见有BMP-7、HGF、VEGF表达，两组间差异无统计学意义，C组表达量均显著低于A、B组（P〈0．05或P〈0．01）。结论EPO干预可增强mBM-MSC的分化功能，并逆转其低分泌效应。
- 刘楠梅田军王巍巍韩国锋程劲黄健张金元
- 关键词：红细胞生成素间质干细胞细胞分化细胞因子类急性肾损伤
- 骨髓间充质干细胞干预对急性肾损伤鼠肾脏中细胞因子的影响被引量：5
- 2010年
- 目的:建立缺血再灌注(I/R)诱导的急性肾损伤小鼠模型,探讨外源性地给予骨髓间充质干细胞(MSCs)干预对模型小鼠肾损伤微环境中细胞因子水平的影响,并探讨其在肾损害修复中的作用。方法:采用Percoll密度梯度离心法分离出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞(mMSCs)。雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常对照组(15只)、I/R组(15只、夹闭双侧肾蒂30min开放)、I/R+mMSCs组(15只、夹闭双侧肾蒂30min开放的同时尾静脉注射mMSCs)。于建模后1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠(每次每组均处死3只),留取动脉血及肾组织,检测血尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)水平,制作肾组织切片行HE染色,观察肾组织病理变化,行肾小管坏死程度评分(ATN评分)。ELISA法检测肾组织匀浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-10(IL-10)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的水平。结果:I/R组小鼠的BUN及Scr均显著高于正常对照组,肾小管损伤严重;而I/R+mMSCs组小鼠的BUN及Scr水平较I/R组为低,以术后第7天差异最为显著(P<0.01),肾小管损伤病理明显减轻,ATN评分也有着显著降低。ELISA结果显示单纯I/R组各时间点肾组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MCP-1的水平显著升高(P<0.01或P<0.05),而IL-10、HGF、BMP-7的水平却有着显著降低(P<0.01或P<0.05)。但同时给予MSCs干预的I/R小鼠肾组织匀浆中前述细胞因子的水平却向着相反方向改变。结论:MSCs对I/R肾组织中细胞因子的分泌具有调控作用,而这些调控了的细胞因子进而可通过旁分泌作用发挥促进肾损害的修复作用。
- 刘楠梅田军程劲胡大勇张金元
- 关键词：骨髓间充质干细胞缺血再灌注细胞因子
- 骨髓间充质干细胞向急性肾损伤小鼠的肾脏归巢现象及功能探讨被引量：16
- 2009年
- 目的:观察在缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模拟急性肾损伤的小鼠模型中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否向损伤的肾小管迁移并促进其修复。方法:Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法有效分离纯化出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞(mMSCs),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记并采用免疫组化法鉴定。雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常对照组(15只)、I/R组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放)、I/R+BrdU-mMSCs组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放的同时尾静脉注射经BrdU标记的mMSCs)。于建模后1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠(每次每组均处死3只),留取动脉血及肾组织,检测血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)水平,观察肾组织病理变化,荧光组织化学及免疫组织化学观察MSCs在受体小鼠肾组织的分布并对其进行鉴定。结果:经免疫组化证实BrdU标记mMSCs的阳性率可达(98.71±0.32)%。I/R组、I/R+BrdU-mMSCs组小鼠的BUN及SCr均显著高于正常对照组,但I/R+BrdU-mMSCs组小鼠的BUN及SCr水平却较同一时间点的I/R组为低,肾小管损伤程度评分也有着显著降低。免疫组化检测显示I/R+BrdU-mMSCs组小鼠肾脏中可检测到BrdU+细胞的分布,以术后第3天最多[(19.36±6.94)%]。经荧光组织化学及激光共聚焦显微镜观察证实该BrdU+细胞定位于小鼠的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)处,且表达RTECs特异性的标志物角蛋白18(cytokertain-18,CK18)。结论:小鼠发生I/R诱导的急性肾损伤后可诱导MSCs向损伤的肾小管上皮迁移并转化,参与RTECs的更新,促进肾损伤的修复。
- 刘楠梅田军程劲胡大勇张金元
- 关键词：骨髓间充质干细胞缺血再灌注肾小管上皮细胞
- 急性肾损伤微环境对培养骨髓间充质干细胞分化及分裂增殖的影响被引量：7
- 2010年
- 目的:观察体外模拟急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的微环境下,小鼠骨髓间充质干细胞(mouse mesenchymal stem cells,mMSCs)分化及分裂增殖情况。方法:采用夹闭雄性C57BL/6小鼠双侧肾蒂30min再开放30min的方法制作缺血再灌注(I/R)性AKI鼠模型,即刻取双侧肾脏皮质制作I/R肾脏匀浆上清。抽取C57BL/6小鼠的骨髓,经Percoll密度梯度离心联合贴壁培养法分离纯化出mMSCs,以流式细胞仪鉴定。取扩增3代的mMSCs分组培养:(1)对照组:含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基;(2)干预组:含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基+I/R肾脏匀浆上清。诱导1d、3d、5d、7d后倒置显微镜下观察细胞形态学变化;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞仪检测角蛋白18(cytokeratin18,CK18);CCK-8法检测培养mMSCs的增生;TUNEL法检测mMSCs凋亡。结果:分离获得的P3-mMSCs高表达CD29和CD44,低表达CD34和CD45。与对照组长梭形细胞相比,干预组第3天可见部分细胞为椭圆形、短梭形,至第7天大部分细胞呈圆形、椭圆形、短胖梭形;透射电镜也观察到胞质内开始出现较多的粗面内质网、溶酶体、线粒体。流式细胞仪检测发现,对照组mMSCs内仅有极微量CK18表达,而干预组CK18阳性表达率显著增加。经I/R肾脏匀浆上清干预后,不同时间点mMSCs的增殖效应均显著减弱,而TUNEL检测显示胞核染色阳性的细胞百分比有显著升高(P<0.01)。结论:体外模拟的AKI微环境可诱导mMSCs部分分化为肾小管上皮样细胞,但同时也会导致培养的mMSCs凋亡,增殖能力减弱,进而减少了可肾向分化的mMSCs数量,推测这可能是MSCs体内移植促肾修复能力有限的原因之一。
- 刘楠梅田军王巍巍程劲胡大勇张金元
- 关键词：肾脏损伤骨髓间充质干细胞分化
- 红细胞生成素对模拟急性肾损伤微环境下培养骨髓间充质干细胞增殖的影响及机制探讨被引量：10
- 2011年
- 目的观察经红细胞生成素（EPO）干预后，体外模拟急性肾损伤（AKI）微环境下培养骨髓间充质干细胞（MSC）的分裂增殖情况，并探讨产生这种变化的可能机制。方法抽取C57BL／6小鼠的骨髓，经Percoll密度梯度离心联合贴壁培养法分离纯化出小鼠MSC（mMSC），以流式细胞仪鉴定。夹闭雄性C57BL／6小鼠双侧肾蒂30min再开放30rain的方法制作AKI鼠模型，即刻取双侧肾脏皮质制作缺血再灌注（IR）肾脏匀浆上清。取扩增第3代的mMSC分组培养：A组：含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基；B组：含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基＋IR肾脏匀浆上清，体外模拟AKI微环境干预mMSC；C组：含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基＋IR肾脏匀浆上清＋不同浓度EPO（1、5、10、50U／m1）。培养1、3、5、7d。CCK-8法检测各组培养mMSC的增殖，TUNEL法检测mMSC凋亡，Western印迹法检测mMSC表面EPO受体（EPOR）及增殖凋亡相关信号通路蛋白的表达。结果CCK-8法检测显示，经IR肾脏匀浆上清干预后，不同时间点mMSC的增殖效应显著减弱（P〈0．01），而TUNEL检测表明其胞核染色阳性细胞的百分比显著高于A组（P〈0．01）；给予EPO干预后，mMSC的增殖能力增强，胞核染色阳性细胞百分比降低，具有浓度依赖效应。Western印迹结果显示，第3代mMSC表面存在EPOR表达，培养5d后EPOR相对表达量为0．092±0．015。EPO以剂量和时间依赖性降低AKI微环境下凋亡相关蛋白caspase-3的表达，同时上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。用10U／mlEPO干预5d后，相对于B组，磷酸化蛋白酪氨酸激酶2及磷酸化信号转导和转录因子的表达均显著上调（均P〈0．01）。结论EPO能促进体外AKI微环境干预下培养mMSC的增殖，减轻其凋亡，该效应经EPOR介导，并与增殖凋亡相关信号通路蛋白有关。
- 刘楠梅田军王巍巍程劲胡大勇张金元
- 关键词：红细胞生成素间质干细胞移植细胞增殖急性肾损伤
