国家自然科学基金(30471292)
- 作品数：11 被引量：133H指数：7
- 相关作者：吴斌陈焕春汤细彪赵战勤何华更多>>
- 相关机构：华中农业大学河南科技大学中国兽医药品监察所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划湖北省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达被引量：8
- 2006年
- 皮肤坏死毒素(Dermonecrotictoxin,DNT)是产毒素多杀性巴氏杆菌(ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T+Pm的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列,共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序,结果表明,toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99.8%以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得大小约173000的融合蛋白。Westernblot结果表明,该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体,并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。
- 王大鹏吴斌周锐唐先春陈焕春
- 关键词：克隆
- 猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其免疫原性与抗体检测ELISA方法研究
- 支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎。更重要的是,该菌的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,加重病情造成较严重损失。百日咳杆菌黏附素是由Bbprn...
- 赵战勤薛云吴斌汤细彪何华胡睿铭张建民陈焕春
- 关键词：支气管败血波氏杆菌免疫原性ELISA
- 文献传递
- 猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究被引量：31
- 2008年
- 【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定,药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中,不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9%)、副猪嗜血杆菌(50.0%)、大肠杆菌(43.1%)、巴氏杆菌(25.5%)、绿脓杆菌(17.6%)和沙门氏菌(11.8%)。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb,而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明:各菌株对15种药物的耐药谱不同,但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。
- 赵战勤裴洁薛云汤细彪吴斌何华周学利程相朝何启盖陈焕春
- 关键词：支气管败血波氏杆菌流行病学毒力因子
- 应用巢氏PCR方法快速检测猪鼻拭子样品中产毒素多杀性巴氏杆菌被引量：7
- 2007年
- 根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增的片段大小分别为864和447 bp,从而建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素多杀性巴氏杆菌的巢氏PCR方法。该方法能检出26CFU菌量以上的模板DNA,且不能从猪的其它7种常见病原菌扩增到特异性条带。通过对5个不同地区阳性猪群中采集的146份临床鼻拭子样品进行巢氏PCR检测和细菌分离鉴定,结果2种方法同时为阳性的样品有44份,同时为阴性的样品有97份,另有5份样品只有巢氏PCR检测为阳性,巢氏PCR检测与细菌分离鉴定的符合率为96.58%。试验表明:巢氏PCR方法能快速、灵敏地从猪鼻拭子样品中检出产毒素多杀性巴氏杆菌,适合临床进行大规模病原学检测,具有良好的应用前景。
- 汤细彪吴斌刘国平杨明柳罗勇卢顺陈焕春
- 关键词：产毒素多杀性巴氏杆菌
- 重组产毒多杀性巴氏杆菌毒素PMT的N-端和C-端蛋白的生物学活性及免疫原性被引量：9
- 2008年
- 将5个toxA基因片段N1518、C2345、N3172、N3388和C2115分别克隆到合适的原核表达载体pET-28a(b,c)系统,其中pET28a-N1518和pET28b-C2115在大肠杆菌成功表达,获得大小分别为57kDa和78kDa的融合蛋白rPMT-N和rPMT-C,Western blot检测证实两种表达产物均具有反应原性。分别以200μg rPMT-N和rPMT-C对小白鼠进行体内生物学活性试验,结果两种表达蛋白均不能致死小白鼠;体外细胞毒性试验证实896ng/mL的rPMT-N能使Vero细胞发生病变,而rPMT-C对Vero细胞无明显毒性作用。将rPMT-N和rPMT-C制成亚单位疫苗,同时设天然PMT及无菌PBS对照组,间隔2周分2次皮下免疫小白鼠。二免后2周用8.2×10~5 CFU的HN-13株T^+Pm进行腹腔攻毒,结果rPMT-N组保护率为90.0%(9/10),rPMT-C组保护率为50.0%(5/10),天然PMT组保护率为80.0%(8/10)。综上试验表明,rPMT-N具有良好的生物学活性和免疫原性,可作为PAR疫苗添加成分,显示了良好的应用前景。
- 汤细彪吴斌赵战勤邓永何华何启盖陈焕春
- 关键词：产毒多杀性巴氏杆菌PMT生物学活性免疫原性
- 猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究
- 用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(pasteurela multocida,...
- 唐先春吴斌索绪峰王大林陈焕春尹争艳
- 关键词：多杀性巴氏杆菌产毒多杀性巴氏杆菌PCR药敏试验
- 文献传递
- 猪支气管败血波氏杆菌菌毛fimD基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2009年
- 参照GenBank上支气管败血波氏杆菌的菌毛fimD基因序列(X75811),设计1对引物,从本实验室分离鉴定的猪源支气管败血波氏杆菌中扩增出fimD编码区1 098 bp的片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达。SDS-PAGE和Western blot检测证实该表达产物以包涵体形式存在,大小约42 ku,与用支气管败血波氏杆菌菌体制备的阳性血清能发生特异性反应。将包涵体变性和复性后包被酶标板建立间接ELISA(fimD-ELISA),特异性良好。用fimD-ELISA检测临床送检的668份血清,阳性率为30.7%。用该法与微量凝集试验平行检测102份血清,fimD-ELISA的敏感性高于微量凝集试验。
- 何华裴洁吴斌赵战勤张建民罗勇向敏卢顺
- 关键词：支气管败血波氏杆菌克隆ELISA
- 猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素PMT的提纯、对Vero细胞生物学活性及其毒素抗体的制备
- 将猪产毒多杀性巴氏杆菌(T+Pm)增菌后经超声波破碎,用DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-200处理,提纯天然毒素PMT。Western blot和细胞活性试验证实,该毒素具有良好的反应原性,且7ng/m...
- 汤细彪满晓营杨明柳何华赵战勤吴斌陈焕春
- 关键词：产毒多杀性巴氏杆菌PMT生物学活性
- 文献传递
- 猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达被引量：15
- 2005年
- 利用已分离的菌株030224HB,根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物,用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH),扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp),并克隆到载体pMD18T(TVector),测序表明该基因相当保守。用pET28b构建了原核表达载体pET28bompH,转化BL21并诱导表达,SDSPAGE结果显示表达蛋白约为35ku,与报道大小相近。Westernblot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性,然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。
- 吴斌唐先春陈焕春王大鹏
- 关键词：多杀性巴氏杆菌克隆原核表达ELISA
- 猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究被引量：53
- 2005年
- 用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66 株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型Pm,1株为B型Pm,1株无法定型;有8株用PCR检测为T+ Pm;豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8 株T+ Pm都为D型,都分离于有严重PAR症状的猪。
- 唐先春吴斌索绪峰王大林陈焕春尹争艳
- 关键词：多杀性巴氏杆菌PCR方法生化鉴定萎缩性鼻炎PCR鉴定毒素基因
