国家自然科学基金(31100054)
- 作品数：7 被引量：16H指数：2
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- 相关机构：天津科技大学江苏诚意药业有限公司更多>>
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程医药卫生更多>>
- 枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5’-肌苷酸被引量：1
- 2015年
- 5’-肌苷酸作为新一代增味剂的重要组成成分,在调味品行业具有十分重要的地位。为进一步缩短5’-肌苷酸生产周期,降低生产成本,在研究来源于摩氏摩根菌Morganella morganii的酸性磷酸酶AP/PTaseM催化条件基础上,将该酶编码基因pho CYM克隆至肌苷生产菌株Bacillus subtilis JG,获得B.subtilis JAB和B.subtilis JAF,并根据重组菌株合成肌苷及表达酸性磷酸酶的特性,通过调控发酵条件实现了肌苷发酵和酶催化相偶联的二步发酵法生产5’-肌苷酸。经摇瓶发酵实验验证,两菌株5’-肌苷酸产量分别为2.4 g/L和3.0 g/L。
- 何菊华吴雪娇谢希贤徐庆阳徐庆阳陈宁
- 关键词：酸性磷酸酶枯草芽孢杆菌二步发酵法
- 过表达PNP对肌苷生产菌合成利巴韦林的影响被引量：2
- 2015年
- 采用PCR技术从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组DNA中扩增其编码嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)的两个基因deo D(PNP702)和pup G(PNP816).以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(B.,subtilis)Q60为出发菌株,分别采用胞内与胞外分泌过表达PNP的方式构建4株重组菌株,通过外源添加底物1,2,4–三氮唑–3–羧氨酰(TCA)的方式直接合成利巴韦林.摇瓶发酵数据显示,胞内过表达PNP702和PNP816的利巴韦林产量分别为(8.33±0.57),g/L和(11.00±0.38),g/L.胞外分泌过表达PNP702和PNP816的利巴韦林产量分别为(9.06±0.17),g/L和(12.67±0.60),g/L.PNP816的催化效率高于PNP702,胞外分泌过表达比胞内过表达高,其中胞外分泌过表达PNP816重组菌Q60/p BSApup G最高,比出发菌(2.02±0.72),g/L提高了5.3倍.
- 杨书尧刘莉马跃超陈宁谢希贤
- 关键词：利巴韦林肌苷嘌呤核苷磷酸化酶发酵
- 利用响应面法优化枯草芽孢杆菌产尿苷发酵培养基被引量：5
- 2015年
- 采用响应面法对枯草芽孢杆菌产尿苷发酵培养基进行优化,以期提高尿苷的产量。首先利用PlackettBurman实验设计筛选出影响尿苷产量的3个显著因素:酵母粉,谷氨酸钠,豆粕水解液;在此基础上利用最陡爬坡实验逼近响应值的最佳区域;最后通过中心复合实验和响应面分析确定了影响产苷主要因素的最佳浓度,分别为酵母粉25.6 g/L,谷氨酸钠25.2 g/L,豆粕水解液40.9 m L/L,此时尿苷产量的预测值为13.76 g/L。通过模型的验证实验发现,尿苷的实际产量为13.52 g/L,与模型预测值非常接近,并且比初始培养基提高了164.1%。
- 郭磊吴鹤云张成林徐庆阳徐庆阳陈宁
- 关键词：枯草芽孢杆菌尿苷响应面培养基优化
- 枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响被引量：1
- 2014年
- 【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。
- 刘玥何菊华谢希贤徐庆阳张成林陈宁
- 关键词：枯草芽孢杆菌腺苷启动子
- 固定化重组大肠埃希菌催化合成利巴韦林被引量：1
- 2016年
- 构建了一株能高效表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21(p ET-His-pup G)。选择不同包埋剂进行细菌细胞固定化,结果显示明胶的包埋效果较好。进一步确定明胶包埋细胞的最适反应条件:温度55℃,菌体包埋浓度200 g/L,固定化细胞用量20 g/L,催化周期20 h。在p H 7.6的磷酸盐缓冲液中,底物鸟苷和1,2,4-三唑-3-甲酰胺(TCA)浓度均为100 mmol/L,采用上述固定化细胞催化合成利巴韦林,连续反应8次后,固定化细胞仍具有较高的酶活力。
- 王法松曹化杰徐庆阳陈宁谢希贤
- 关键词：利巴韦林明胶固定化细胞催化合成
- 解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响被引量：6
- 2012年
- 【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。
- 何逵夫马跃超杜姗姗谢希贤徐庆阳陈宁
- 关键词：鸟苷
- 嘌呤核苷磷酸化酶不同表达方式对发酵利巴韦林的影响
- 2015年
- 嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pup G基因编码)是合成利巴韦林的关键酶,本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208发酵生产利巴韦林的影响。以B.amyloliquefaciens TA208为出发菌株,分别利用基因过表达和无标记整合技术,成功构建了B.amyloliquefaciens TA2081和TA2082。通过实时定量PCR测定这3株菌pup G基因的转录水平,结果表明与B.amyloliquefaciens TA208相比,TA2081和TA2082的转录水平均有提高,但TA2081提高的更为显著;通过测定PNPase活性发现,B.amyloliquefaciens TA2081和TA2082的PNPase活力分别为出发菌株TA208的2倍和1.30倍。7.5 L分批补料发酵实验表明,与出发菌B.amyloliquefaciens TA208相比,工程菌TA2081鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率从20.41%提高到98.63%,TA2082的转化率从20.41%提高到40.95%。综上所述,增加pup G的表达量能提高利巴韦林的产量,本研究为利巴韦林生产菌的代谢工程改造提供了理论依据和技术指导。
- 刘莉李燕军谢希贤谢希贤
- 关键词：解淀粉芽孢杆菌利巴韦林嘌呤核苷磷酸化酶
