国家高技术研究发展计划(2002AA245061)
- 作品数：11 被引量：71H指数：5
- 相关作者：严若峰李祥瑞徐立新覃宗华蔡建平更多>>
- 相关机构：南京农业大学中国农业大学广东省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因在大肠杆菌的表达被引量：2
- 2005年
- 根据克隆的毒害艾美耳球虫 (Eimeria necatrix)广东株微线蛋白 - 2基因 (En MIC- 2 (Gd) )的 c DNA序列设计特异性引物 ,用 PCR方法扩增其阅读框架 (ORF)后 ,克隆至质粒表达载体 p ET- 32 a(+) ,成功构建了重组表达质粒 p ET-32 a(+) - En MIC- 2。用 Ca Cl2 法将其转化至宿主细菌 E.coli BL2 1(DE3) ,并用 IPTG成功诱导了 En MIC- 2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的 10 .8% ,其相对分子质量约为 5 5 0 0 0。重组蛋白经 SDS- PAGE分析后 ,用 E.necatrix(广东株 )感染鸡的高免血清进行 Western Blotting分析 。
- 覃宗华谢明权蔡建平艾哈迈德彭新宇魏文康吴惠贤
- 关键词：大肠杆菌表达MIC基因重组抗原广东株毒害艾美耳球虫
- 鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定
- 2010年
- [目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个(GGGGS)3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。
- 徐守振汪明
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫3-1E基因IFN-Γ基因DNA疫苗
- 鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验被引量：4
- 2006年
- 给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria enella）和／或堆形艾美耳球虫（E．acervulina），孢子化卵囊，出雏后在无球虫环境中笼养，1～10日龄每天收集各组粪便样本，计数克粪便卵囊数（OPG），并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫，以相对增重率（RWG）、饲料转化率（FCR）、相对卵囊产量（ROP）评价免疫保护效果。结果显示，以E．tenella或E．acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚，其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致，有相似的排卵囊曲线，提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31．9％～51．7％提高到了76．5％～83．6％，RCR由攻虫对照组的4．11～4．89改善为2．72～2．96，ROP降至4．7％～23．5％。结果表明以一定剂量E．tenella和E．acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫Etenel／a和E．acervulina卵囊组与单一接种Etenella或E．aeervulina卵囊组的免疫效果发现，混合免疫组的各项指标均稍优于后者。
- 党海斌蔡建平于三科覃宗华叶秀华林青陈闻简永利
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫堆形艾美耳球虫卵囊鸡胚免疫
- 2种鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗的构建及在鸡体内的表达
- 利用DNA重组技术,将柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenalla）第2代裂殖子抗原基因MZ5-7的完整阅读框（ORF,945bp）克隆到真核表达质粒pcDNA4.0中,构建DNA疫苗DcDNA4.0-MZ。用同样方法...
- 格日勒图徐立新严若峰李祥瑞
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫IL-17DNA疫苗
- 文献传递
- 2种鸡柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗的构建及在鸡体内的表达被引量：5
- 2005年
- 利用DNA重组技术,将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenalla)第2代裂殖子抗原基因MZ5-7的完整 阅读框(ORF,945 bp)克隆到真核表达质粒pcDNA4．0中,构建了DNA疫苗pcDNA4．0-MZ。用同样方法,将鸡成 熟白细胞介素-17(IL-17)基因的完整阅读框(507 bp)与MZ5-7基因串连,使MZ5-7基因位于IL-17基因的上游, 将串连基因克隆到pcDNA4．0中,构建成免疫调节型DNA疫苗pcDNA4．0-MZ-IL-17。2种DNA疫苗纯化后,胸 部肌肉注射免疫1周龄雏鸡(50 μg／鸡),在免疫后3．5,7,15和20 d取注射和非注射部位肌肉组织,分别用RT- PCR和Western blot方法检测抗原基因转录和表达情况。结果表明,在2种疫苗免疫后5,7和15 d,用RT-PCR 方法在注射部位均可检测到MZ5-7基因的转录产物,大小约950 bp,但在免疫第3天和20天的肌肉组织中未检测 到表达产物。相同时间用Western blot方法进行检测,结果在免疫5和7 d的鸡肌肉组织中检测到表达产物,pcD- NA4．0-MZ表达产物大小约36 ku,与理论推测值一致,pcDNA4．0-MZ-IL-17表达产物大小约64 ku,较MZ5-7和 IL-17基因之和的理论推测值58 ku略大。但在非注射部位,两种方法均未检测到转录或表达产物。上述结果表明, 通过肌肉注射后,两种DNA疫苗均可在鸡肌肉组织中得到有效表达。
- 格日勒图徐立新严若峰李祥瑞
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫IL-17DNA疫苗
- 鸡柔嫩艾美尔球虫第二代裂殖子表面抗原MZ5-7基因的克隆、表位分析及原核表达被引量：2
- 2005年
- 用RTPCR的方法,从感染柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)第5天的鸡盲肠分离的第二代裂殖子中克隆出MZ57基因,并进行抗原表位分析和原核表达,结果表明,MZ57基因ORF为945bp,与GenBank里已知序列(登录号为L08257)比较核甘酸和氨基酸同源性均为99.9%。应用DNAStar软件对该基因的抗原表位进行了分析,发现其B细胞表位广泛分布在80～300区域,其中80～130区域、190～220区域和300～320区域更为突出,而T细胞基序则集中在123～190区域和220～300区域。根据MZ57基因序列重新设计一对引物,PCR方法扩增出不含信号肽长度为885bp的基因序列,克隆到pET28b获得重组质粒pET28bMZ亚,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白约36.5kDa10poundnote,符合目的蛋白大小;同时应用Westernblot方法与抗第二代裂殖子和子孢子的2种高免血清反应,结果表明抗裂殖子和子孢子血清均能识别MZP(裂殖子蛋白,MZP,merozoiteprotein)。
- 格日勒图严若峰徐立新李祥瑞
- 关键词：柔嫩艾美尔球虫原核表达表位分析基因克隆
- 柔嫩艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究被引量：28
- 2004年
- 将 E.tenella BJ株的保护性抗原基因 TA4插入真核表达载体中 ,然后在其上游融合方式插入 Et1A基因 ,构建成核酸疫苗并进行体外表达。IFAT检测表明 ,p CT转染细胞的荧光亮度高 ,p CTE载体大 ,转染效率低 ,荧光较弱。动物保护性试验中 ,间隔一周两次免疫鸡后攻虫发现 ,核酸疫苗对球虫感染具有明显的保护作用 ,可显著减轻球虫感染引起的机体增重下降 ,其中 ,重组干扰素联合 p CT中剂量 (5 0 μg)免疫时 ,鸡的增重效果最为明显 ,盲肠病变值也最小 ,ACI可达 16 7.2。试验还发现 ,5 0 μgp CTE可达到 10 0 μg p CT的抗球虫效果 ,ACI在 16 0以上 。
- 吴绍强蒋金书刘群朱引洁
- 关键词：核酸疫苗免疫保护力
- 鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：2
- 2008年
- 分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT-PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)江苏分离株5401基因。测序结果表明该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T。第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达。用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90kDa和80kDa左右。
- 黄欣梅宋小凯徐立新严若峰李祥瑞
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫克隆原核表达
- EnMIC2重组减毒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究被引量：19
- 2005年
- 成功构建了表达鸡毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)广东株(GD)微线蛋白2基因(EnMIC2)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,在IPTG诱导下获得了EnMIC2的高效表达,SDSPAGE分析表明,表达产物约占菌体总蛋白的8.6%,分子量大小约为35ku,与抗E.necatrix的高免血清进行WesternBlotting,结果为阳性。将重组减毒沙门氏菌以108和109CFU/鸡免疫4日龄岭南黄肉鸡,免疫后2周血清中可检测到特异性IgG,3周时抗体水平达到峰值,同时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫接种后3周,试验鸡分别经口攻击感染500个E.necatrix(GD)孢子化卵囊,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线;但108和109CFU免疫组的卵囊总产量分别能降低26.62%和48.92%。
- 谢明权覃宗华蔡建平艾哈迈德彭新宇魏文康吴惠贤
- 关键词：毒害艾美耳球虫减毒沙门氏菌免疫保护
- 柔嫩艾美耳球虫甘肃株钙调域蛋白激酶基因的克隆与表达被引量：6
- 2005年
- 应用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)技术,从柔嫩艾美耳球虫甘肃株(E.tenellaGS,EtGS)孢子化卵囊的子孢子中提取总RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原钙调域蛋白激酶(CDPK)基因。将EtGSCDPK基因与原核表达载体pGEX6P1连接,构建了pGEXCDPK原核表达质粒,并获得高效表达和纯化的CDPK融合蛋白,表达率达35.4%。序列分析表明:EtGSCDPK与文献报道的EtCDPK比较,共有5个核苷酸发生变异,核苷酸同源性为99.6%;有5个氨基酸发生变异,氨基酸同源性为98%。
- 周建民鲍杰汪明
- 关键词：鸡球虫CDPK
