教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-11-0658)
- 作品数：11 被引量：30H指数：3
- 相关作者：倪晔孙志浩许国超张龙王云更多>>
- 相关机构：江南大学更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程动力工程及工程热物理更多>>
- 随机突变结合理性设计改进生理pH下精氨酸脱亚胺酶的性质被引量：2
- 2013年
- 精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI)因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注.目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临床研究阶段.作为药用酶,当前报道的ADI在体内生理条件下普遍存在酶活低、半衰期短、底物亲和性弱等局限性.本研究结合随机突变及基于理性设计的定点突变两种方法,对研究室前期自主筛选得到的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida来源的ADI经一轮定向进化后所获优势突变株M314(A128T/H404R/I410L)进行分子改造.通过对随机突变法获得的1480个突变株进行96孔板高通量筛选,得到优良突变株M173(A128T/H404R/I410L/K272R);同时,基于同源序列比对及ADI蛋白三维结构同源建模,采用PyMOL软件理性预测和分析其活性中心及附近保守区域氨基酸位点对蛋白功能的影响,选择了6个位点D78E、L223I、P230I、S245D、A275N、R400M分别在M314的基础上进行定点突变,最终获得优势突变株M04(A128T/H404R/I410L/S245D).通过对突变株的酶学性质以及动力学参数分析发现:生理pH值下,突变株M173的酶比活(12.32 U/mg)在M314(9.02 U/mg)的基础上提升36.59%,Kcat/Km提高52.36%;而突变株M04的最适pH由6.5升高至7.0,更接近体内生理pH,其比酶活(14.66 U/mg)较M314提升62.53%,Kcat/Km提高了37.12%.综上结果,本研究结合两种分子改造方法成功地对该ADI在生理pH条件下的酶活和酶学性质进行了改良,并为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据.
- 刘梦晗倪晔张龙章凯孙志浩
- 关键词：精氨酸脱亚胺酶随机突变定点突变
- 响应面法优化重组大肠杆菌产ADI酶发酵培养基被引量：3
- 2015年
- 在单因素优化的基础上,采用响应面分析方法对重组大肠杆菌生产精氨酸脱亚胺酶(ADI)的发酵培养基进行了优化。借助于SAS软件,结合Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计对5种培养基组分进行优化。结果表明,最佳培养基组分为胰蛋白胨11.16 g/L,酵母提取物20 g/L,甘油6.3 g/L,磷酸氢二钾16.38 g/L,磷酸二氢钾2.31 g/L。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,ADI酶活达到5.7 U/m L发酵液,比初始培养基(3.72 U/m L发酵液)提高了1.53倍,比LB培养基(2.83 U/m L发酵液)提高了2.01倍。采用优化后的培养基在3 L发酵罐中进行发酵,ADI酶活达到15.17 U/m L发酵液,较LB培养基(4.32 U/m L发酵液)提高了3.51倍。
- 张龙司海明倪晔
- 关键词：培养基优化响应面
- 产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性
- 2016年
- 为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。
- 李磊许国超韩瑞枝倪晔
- 关键词：D-海因酶D-氨基酸荧光假单胞菌
- 利用定点突变法研究精氨酸脱亚胺酶活性的影响机制被引量：2
- 2012年
- 精氨酸脱亚胺酶(ADI)是一种针对精氨酸缺陷型癌症(如:肝癌、黑素瘤)的新药,目前处于临床三期试验。文中通过定点突变技术分析了精氨酸脱亚胺酶的特定氨基酸位点对酶活力的影响机制。针对已报道的关键氨基酸残基A128、H404、I410,采用QuikChange法进行定点突变,获得ADI突变株M1(A128T)、M2(H404R)、M3(I410L)和M4(A128T/H404R)。将突变株在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并对纯化获得的突变蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变位点A128T和H404R对ADI最适pH的提高,生理中性(pH 7.4)条件下的酶活力和稳定性的提高,以及Km值的降低均具有显著的作用。研究结果为阐明ADI的酶活力影响机制和蛋白质的理性改造提供了一定的依据。
- 李利锋倪晔孙志浩
- 关键词：精氨酸脱亚胺酶定点突变蛋白质纯化酶活力最适PH抗癌
- 高产(+)γ-内酰胺酶菌株的筛选与发酵产酶研究被引量：5
- 2012年
- 从土壤中筛选获得高产(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株,并鉴定和保藏为Delftia sp.CGMCC No.5755。对该Delftia sp菌株的发酵产酶条件进行了研究,结果表明,最适发酵培养基为:蔗糖30 g/L,蛋白胨30 g/L,牛肉膏25 g/L,乙酰胺5 g/L,MgSO41 g/L;最适发酵温度及初始pH分别为32℃和pH 7.0。该菌株在上述条件下发酵培养20 h,菌体生物量为16.0 g/L,(+)γ-内酰胺酶的酶活为692 U/L。采用Delftia sp.静息细胞对100 g/L的外消旋底物2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(简称(±)γ-内酰胺)的水解拆分反应中,产物(-)γ-内酰胺光学纯度大于99.9%e.e.,转化率为53.7%。研究为生物催化法高效制备光学纯(+)γ-内酰胺提供了可行的途径。
- 陈红干倪晔孙志浩
- 不对称还原制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的双酶共表达重组菌的构建被引量：2
- 2012年
- 克隆了来自于枯草芽孢杆菌的羰基还原酶基因IolS和葡萄糖脱氢酶基因GDH,采用Ni-NTA镍亲和层析柱对重组蛋白IolS进行纯化,并对纯酶进行了酶学性质研究.结果表明,该羰基还原酶的最适温度和pH值分别为30oC和6.0;在40oC以下具有较好的热稳定性;在pH5.57.0的偏酸性范围内能保持75%以上的酶活.采用三种策略构建了IolS和GDH的共表达重组质粒,结果发现,采用双启动子的重组质粒能够实现羰基还原酶IolS的高效表达,粗酶液中的IolS和GDH的比酶活均达到1.5U/mg.运用该重组菌对10g/L的OPBE进行不对称还原,反应15h后,底物转化率大于99%,产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的ee值达到99.5%.
- 宿宇宁倪晔王骏超徐志豪孙志浩
- 关键词：羰基还原酶葡萄糖脱氢酶共表达(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯
- 利用Clostridium saccharobutylicum DSM 13864连续发酵生产丁醇被引量：8
- 2013年
- 为使用廉价糖质原料进行连续发酵生产丁醇提供理论依据和实验指导,以Clostridium saccharobutylicumDSM 13864为发酵菌种,考察了稀释率和温度等因素对以葡萄糖为原料的四级连续发酵生产丁醇的影响。结果表明:高稀释率有利于酸的积累和菌体的生长,低稀释率有利于溶剂的生产。当稀释率为0.05 h 1,4个发酵罐温度控制在37℃时,总溶剂产量为11.57 g/L,其中丁醇7.29 g/L,生产率为0.145 g/(L.h)。在0.05 h 1稀释率的条件下进行变温连续发酵证实低温有利于溶剂的积累,当一级和二级罐温度控制在37℃,三级和四级罐温度控制在33℃时总溶剂产量最高为13.69 g/L,其中丁醇为8.36 g/L,生产率为0.171 g/(L.h)。
- 夏子义倪晔孙志浩王云吴香玉
- 关键词：CLOSTRIDIUM连续发酵丁醇稀释率温度
- 基于蛋白质组学的假单胞菌耐溶剂机制研究被引量：3
- 2012年
- 【目的】有机溶剂对微生物有强烈的毒害作用致使绝大多数微生物不能在较高的有机溶剂浓度下生长。为了探究微生物的耐溶剂性机制,由野生型假单胞菌Pseudomonas putida JUCS驯化获得一株能够在60%(V/V)的环己烷中生长的菌株P.putidaJUCT1。【方法】采用蛋白质二维电泳对P.putida JUCT1在不同溶剂条件下的蛋白组分表达量的差异进行分析比对。【结果】从总共22个表达量差异均超过50%的蛋白质中,选取了3个高丰度蛋白质,通过MALDI-TOF/TOF鉴定为:3-羟基异丁酸水解酶、蛋白质延伸因子EF-Ts、异分支酸水解酶超家族(编码基因分别为mmsB、tsf、PSEEN0851)。将这3个基因在大肠杆菌中重组表达,3个蛋白均能不同程度地提高E.coli JM109的耐溶剂性,其中3-羟基异丁酸脱氢酶(编码基因mmsB)对菌株的溶剂耐受性影响最为显著。【结论】证明了运用蛋白组学的方法研究微生物的耐溶剂性的可行性,并为构建适用于工业化应用的溶剂耐受性整体细胞生物催化剂提供理论依据。
- 宋亮倪晔孙志浩
- 关键词：耐溶剂性恶臭假单胞菌环己烷
- 羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇被引量：1
- 2012年
- 从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。
- 张蓓花倪晔孙志浩
- 关键词：CANDIDACTAB
- 双芳基酮还原酶的基因挖掘及催化性质被引量：3
- 2018年
- 通过基因挖掘,获得了来源于Kluyveromyces polysporus的醇脱氢酶基因kpadh,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了可溶性表达。其编码的醇脱氢酶KpADH属于短链脱氢酶家族,可催化双芳基酮不对称还原生成手性双芳基醇,且可利用异丙醇为辅底物进行底物偶联型辅因子循环。采用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白KpADH进行纯化,并研究了酶学性质。研究发现:KpADH的还原和氧化反应的最适pH分别为5.5和9.5;KpADH对1-(4'-氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲酮[1-(4'-chlorophenyl)(pyridin-2'-yl)methanone,CPMK]的K_m和V_(max)为0.500mmol/L和25.0μmol/(min·mg),对辅底物异丙醇的K_m和V_(max)分别为6.36 mmol/L和21.4μmol/(min·mg);KpADH对酮酯类底物和2,3-丁二醇有较高的催化活力。运用该重组菌对100 mmol/L的CPMK进行不对称还原,反应10 h后,底物转化率大于99.8%,产物(R)-CPMA的ee值为82%,摩尔收率88.7%。本研究为利用醇脱氢酶KpADH高效合成光学纯CPMA奠定了基础。
- 唐铭烩许国超倪晔
- 关键词：基因挖掘
