国家自然科学基金(30271374)
- 作品数：7 被引量：17H指数：2
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- Rett综合征患儿甲基化CpG结合蛋白2基因和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因的突变被引量：1
- 2009年
- 目的了解Rett综合征（RTT）患儿甲基化CpG结合蛋白2基因（MECP2）和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因（CDKL5）突变及热点突变，建立适合临床诊断的检测方法和策略。方法对1987至2007年北京大学第一医院儿科神经专业组诊断的177例散发RTT患儿抽取外周抗凝血提取DNA，用PCR—DNA测序方法对MECP2的全部外显子进行突变筛查，如未发现突变，用多重连接依赖的探针扩增（MLPA）法进行基因剂量分析。对MECP2未发现突变的患儿用变性高效液相色谱法（DHPLC）进行CDKL5突变筛查。结果在177例患儿中发现145例MECP2突变，1例CDKL5突变，总的突变率82％。MECP2突变中错义突变频率最高（39％）；其后依次为无义（28％）、移码（17％）和大片段缺失突变（14％）。所有突变中8种最常见突变依次为P．T158M（13％）、pR168X（12％）、c．806delG（7％）、p.R255X（6％）、p.R270X和p.R133C各（5％）、p.R306C（4％）、p.R106W（3％）。11％的患儿存在一个或多个外显子的缺失。结论中国R1T患儿MECP2突变谱和国外报道相似，有热点突变。c．806delG是中国人群特有的一个热点突变。
- 李美蓉潘虹包新华朱兴旺曹广娜张玉稚吴希如
- 关键词：RETT综合征细胞周期蛋白质依赖激酶类突变
- 大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定(英文)被引量：2
- 2004年
- 目的以真核表达载体单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1, HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体。方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定。结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体。结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础。
- 王汉森潘虹张玉稚包新华张国荣吴希如
- 关键词：RETT综合征反义RNA
- Rett综合征的临床特征及MeCP2的基因型与表型的关系研究被引量：12
- 2004年
- 目的 总结Rett综合征 (RTT)的临床特点 ,探讨甲基化CpG结合蛋白 2 (MeCP2 )基因突变型与表型的关系。方法 北京大学第一医院儿科 1987年以来诊断的RTT 6 6例 ,每l一 2年对本组患儿进行 1次临床随访 ,并观察左旋肉碱的治疗反应。应用PCR、测序方法对 39例患儿进行突变基因分析。结果 患儿 3— 38个月起病 ,5 9例 ( 89% )患儿于 7个月～ 6岁丧失手的功能 ,6 6例 ( 10 0 % )患儿 1～ 5岁出现手的刻板动作 ,5 6例 ( 85 % )患儿 11个月一 8岁语言完全丧失 ,2 1%的患儿于 2岁 9个月一 15岁丧失原已获得的行走能力。头围小、惊厥、呼吸节律异常、咬牙、脊柱侧凸或后凸均很常见。左旋肉碱治疗 17例 ,8周后 6例症状改善。 39例进行MeCP2基因分析者中有 2 5例 ( 6 4 % )发现突变 ,其中 2例无义突变C5 0 2T(氨基酸改变R16 8X)患儿均死亡 ,2例C397T(氨基酸改变R133C)和1例A398T(氨基酸改变R133H)突变者均保留语言。结论 RTT特征性的表现为头围增长缓慢 ,手的失用与刻板动作 ,语言倒退 ,左旋肉碱可以改善部分患儿的临床症状。
- 包新华潘虹宋福英吴希如
- 关键词：RETT综合征MECP2基因型表型基因突变小儿
- 大鼠Mecp_2基因的RNA干扰有效序列筛选
- 2006年
- 目的：以RNAi技术寻找抑制大鼠Mecp2基因表达的有效序列。方法：首先构建大鼠Mecp2基因与红色荧光蛋白（RFP）的融合基因表达质粒，然后分别与针对大鼠Mecp2基因的4个备选小干扰RNA（siRNA，small interference RNA）共转染HEK293T细胞，构成外源基因系统，以此对于4个备选的siRNA对大鼠Mecp2基因的抑制有效性进行筛选。然后将筛选到的有效序列siRNA转染自身表达大鼠Mecp2基因的PC12细胞，以免疫荧光染色显示大鼠Mecp2蛋白的表达情况，通过内源大鼠Mecp2基因表达被抑制的情况验证所筛选序列的RNA干扰有效性。结果：针对大鼠Mecp2基因mRNA918—936位核苷酸的siRNA（序列：5＇-GCUGUGAAGGAAUCUUCUA-3’）是对大鼠Mecp2基因进行RNA干扰的有效序列。此有效siRNA序列所在的位置相当于大鼠Mecp2基因第4外显子，推测可同时抑制大鼠Mecp2α和大鼠Mecp2β的表达。且此靶序列位于大鼠Mecp2基因编码区，推测可同时抑制1．9kb和10kh的大鼠Mecp2基因mRNA的表达。结论：本研究为建立稳定的大鼠神经元Mecp2基因表达敲低的神经细胞模型和研究脑发育过程中Mecp2基因的功能打下了基础。
- 张玉稚王汉森潘虹李美蓉包新华金靖吴希如
- 关键词：DNA结合蛋白质类DNA甲基化RNA小分子干扰
- 长片段PCR-DNA测序方法在Rett综合征诊断中的应用
- 2007年
- 目的探讨利用长片段 PCR-DNA 测序方法检测 Rett 综合征(RTT)患儿 MECP2基因突变的可行性及临床意义。方法对40例临床诊断的 RTT 患儿用盐析法从外周血提取基因组DNA,采用长片段 PCR 同时扩增 MECP2基因的第3和第4外显子,用1.5%的琼脂糖凝胶鉴定扩增目的片段的大小,进行 DNA 直接测序。结果在40例 RTT 患儿中有33例患儿 MECP2基因存在突变:无义突变16例;错义突变14例;缺失突变3例,其中有一例为314 bp 的大片段基因缺失。突变以p.T158M 最为多见,占21%(7/33),其后依次为 p.R255X,占12%(4/33),p.R168X 和p.R106W 各占9%(3/33),p.R270X 和 p.Y141X 各占6%(2/33),p.R133C、p.D156H、p.F157L、p.P225R、p.Q244X、p.Q262X、p.R294X、p.R306C、P322L、c.1005delG、c.1005-1318del 314 bp 和 c.1127-1179del 53bp 各占3%(1/33)。结论长片段 PCR 方法鉴定了83%(33/40)的 RTT 患儿存在 MECP2基因突变,目前是一种简单、方便、快速、准确的基因诊断方法,能同时发现常见突变和基因大片段的缺失,有助于 RTT 的诊断。
- 李美蓉潘虹包新华曹广娜吴希如
- 关键词：RETT综合征聚合酶链反应DNA结合蛋白质类
- Rett综合征患儿2例MECP2基因大片段缺失突变分析被引量：1
- 2006年
- 目的研究Rett综合征患儿2例MECP2基因用常规突变筛查方法未检出异常者是否存在大片段的缺失突变。方法用标准的盐析法从外周血提取基因组DNA,用多重连接依赖的探针扩增法(MLPA)进行突变分析,对存在突变的样本进一步用长片段PCR-DNA直接测序进行验证,同时确定突变在基因组序列中的位置。结果2例典型的Rett综合征患儿发现第四外显子有大片段缺失突变。例1用MLPA方法发现在第四外显子的4d探针位置存在缺失,长片段PCR-DNA直接测序证实在cDNA的第905至1138位之间缺失234个核苷酸,并且插入三个核苷酸(c.905-1138delinsCAC);例2用MLPA方法发现在第四外显子的4d和4a探针位置存在缺失,长片段PCR-DNA直接测序证实在cDNA的第1047至1198位之间缺失152个核苷酸(c.1047-1198del152)。结论对于常规的突变筛查不能检出MECP2有突变的Rett综合征患儿,进一步进行MLPA筛查是必要的。MLPA不仅简便、快速,而且能够发现大片断缺失。
- 李美蓉潘虹包新华张玉稚吴希如
- 关键词：RETT综合征聚合酶链反应
- 发育中Wistar大鼠大脑皮层甲基化结合蛋白-2基因表达变化被引量：1
- 2004年
- 目的 :研究甲基化结合蛋白 2 (methyl CpG bindingprotein 2 ,mecp2 )基因在发育中正常Wistar大鼠大脑皮层表达水平的变化。方法 :应用实时定量PCR(real timePCR) ,Northern印迹杂交对mecp2基因在正常Wistar大鼠发育的不同阶段 :胚胎第 1 5天 (E1 5 )、第 1 7天 (E1 7)、第 1 9天 (E1 9)、出生当日 (P0 ) ,生后第 7天 (P7)、生后第 1 4天 (P1 4 )、生后第 2 8天 (P2 8) ,成年期大鼠mRNA的表达水平进行定性、定量分析 ;应用Western印迹杂交对MeCP2的表达水平进行半定量分析。结果 :mecp2基因是在正常Wistar大鼠大脑皮层中表达的mRNA ,约为 1 0kb。从胚胎至成年期的发育过程中 ,mecp2基因mRNA的表达虽有波动 ,但差异无显著性。mecp2基因在正常Wistar大鼠大脑皮层中仅表达一种MeCP2 ,相对分子质量为 75 0 0 0。在不同发育阶段其表达水平表现为 ,胚胎E1 5表达水平最低 ,自胚胎E1 9始至成年期MeCP2表达水平较E1 5明显增高。生后第 7日至成年期 ,各时间点间表达水平的变化差异没有显著性。结论 :随着正常Wistar大鼠大脑皮层神经元的发育成熟 ,MeCP2的表达水平逐渐增高 ,说明MeCP2对神经元的成熟有重要作用 。
- 张玉稚潘虹王汉森包新华吴希如
- 关键词：WISTAR大脑皮层基因表达胚胎
