国家自然科学基金(30300319)
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
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- 相关机构：第四军医大学西北农林科技大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人DDR2基因pShuttle-CMV穿梭载体的构建及表达
- 2007年
- 目的:构建带有flag标签的人DDR2 pShuttle-CMV载体,检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布.方法:以含有人全长DDR2cDNA的质粒为模板,用PCR方法扩增DDR2基因的C-端(DDR2-C),并在其C末端带上含24bp的flag标签,NcoI/EcoRV酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18-T载体,即替换掉原有DDR2序列的C-端,引入flag标签,测序正确后再克隆入pShuttle-CMV表达载体,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞,West-ern Blot检测DDR2-flag在细胞中的表达.瞬时转染Hela细胞,通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况.结果:测序及酶切显示DDR2-flag/pShuttle-CMV载体构建符合预期;脂质体法转染HEK293细胞,24h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达;对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜.结论:成功构建并表达了C-末端带flag标签的DDR2真核表达载体,使其在真核细胞中表达,并观察到其亚细胞分布.
- 任婷婷刘新平车红磊张健张璟李霞苏金
- 关键词：DDR2聚合酶链式反应克隆免疫荧光
- GFR/DDR2嵌和受体的构建和稳定表达的鉴定
- 2004年
- 目的 :将一在细胞膜表面不表达或低表达的受体胞外区与盘状结构域受体 2 (DDR2 )的胞内区融合 ,构建一嵌和DDR2受体 ,避免在活化此受体的同时激活与DDR2有相同配体的受体介导的信号通路 ,为探索DDR2介导的胞内信号途径奠定基础 .方法 :采用PCR扩增和限制性酶切的方式 ,将表皮生长因子受体 (EGFR)的胞外区与DDR2的跨膜及胞内区进行融合并稳定转染EGFR低表达的 2 93细胞 ,G4 1 8筛选 ,流式细胞仪检测嵌和受体在膜表面的表达状况 .结果 :成功构建了EGFR/DDR2嵌和表达载体 ;筛选到稳定表达此嵌和受体的 2 93细胞株 .结论 :融合并稳定表达了EGFR/DDR2嵌和受体 .
- 苏金于江天王吉村史曼朱玲张健刘新平药立波
- 关键词：金属蛋白酶类基因表达
- 人p65和IκBα基因真核表达载体的构建及在永生化滑膜细胞中的表达被引量：1
- 2006年
- 目的构建人p65和IκBα基因的真核表达载体并检测其在人永生化滑膜细胞MH7a中的表达.方法应用RT-PCR方法从体外培养的HEK293细胞mRNA中扩增出p65和IκBα基因的编码区,克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1myc/His(-)A,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染MH7a细胞,WesternBlot检测p65和IκBα的表达.结果测序证实PCR扩增得到的p65和IκBα基因编码区序列正确;脂质体法转染MH7a细胞后检测到预期目的蛋白的表达.结论成功构建了p65和IκBα的真核表达载体并使其在人永生化滑膜细胞中表达.
- 程欣王立峰张健刘娜苏金于江天刘新平
- 关键词：P65IΚBΑ逆转录聚合酶链反应
- 盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析
- 2006年
- 目的:寻找使盘状结构域受体2(DDR2)在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径方法:采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFP-N3载体中,转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况.结果:成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体,进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活.结论:DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化,为深入研究DDR2的功能奠定了基础.
- 于江天苏金任婷婷刘新平
- 关键词：盘状结构域受体2EGFP磷酰化
- DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2007年
- 目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达.方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞;RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达.结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中.结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.
- 张燕王保莉苏金车红磊于江天刘新平
- 关键词：盘状结构域受体2FC
