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人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子被引量：2: 2011年; 背景:外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。目的:探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。方法:应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Westernblot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。结果与结论:100μg/L脂多糖刺激6h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用LatrunculinB抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。; 闫承慧于海波张效林康建韩雅玲; 关键词：人脐静脉内皮细胞通透性细胞骨架蛋白 RHOA ERK

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达: 2011年; 背景:血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。目的:构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)融合的真核表达质粒。方法:根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果与结论:经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。; 李杰闫承慧张效林梁振阳冯雪瑶白净韩雅玲; 关键词：TIE2 E1A激活基因阻遏子

高盐激活氧化应激-p38丝裂原活化蛋白激酶-肌动蛋白骨架重组诱导血管内皮细胞损伤被引量：6: 2014年; 目的探讨高盐对血管内皮细胞损伤的生物学作用及其机制。方法用含10%胎牛血清、0.45nmol/L醛固酮的杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）培养人主动脉内皮细胞3d,应用不同浓度NaCl（135、145、155mmol/L）及NaCl（135mmol/L）＋一氧化氮合酶抑制剂——左旋硝基精氨酸甲酯（l-NAME,1μmol/L）刺激内皮细胞3h。Rhodamin-Phalloidin检测内皮细胞纤维型肌动蛋白骨架（F-actin）分布;硝酸还原酶法/酶联免疫吸附试验（ELISA）分析法检测内皮细胞上清中一氧化氮及过氧化亚硝基阴离子（ONOO-）含量的变化;通过Western blot检测内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的亚基gp91、磷酸化p38（P-p38）、磷酸化HSP27（P-HSP27）的蛋白表达量。应用磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（P-p38 MAPK）特异性抑制剂SB203580（25μmol/L,1h）或氧化应激清除剂tempol（1mmol/L,1h）预处理内皮细胞后,检测盐负荷诱导内皮细胞骨架、细胞上清及蛋白表达的改变情况。结果当细胞外钠离子浓度为145-155mmol/L时,较135mmol/L时内皮细胞骨架F-actin增多,细胞上清中一氧化氮含量降低、ONOO-含量增加,且内皮细胞中磷酸化eNOS（P-eNOS）表达量降低,gp91、P-p38、P-HSP27表达量增加。预先给予氧化应激清除剂tempol后,可以缓解由盐负荷引起的内皮细胞损伤。预先给予SB203580后,可以部分缓解由盐负荷引起的内皮细胞损伤。结论高盐通过激活氧化应激及p38通路诱导F-actin重组,进而引起血管内皮细胞eNOS表达降低及一氧化氮释放减少。; 张玉婕朱男张效林闫承慧赵昕韩雅玲; 关键词：血管内皮细胞氧化应激内皮型一氧化氮合酶

E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移被引量：1: 2011年; 背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因。目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制。方法:应用已建立的稳定转染CREG过表达细胞hVSMCs-CREG和CREG表达沉默的hVSMCs-siCREG细胞株通过刮伤实验和Transwell小室细胞移行实验检测细胞迁移能力,通过Western blot检测转染前后细胞中CREG蛋白、基质金属蛋白酶和JNK表达及活化情况,应用JNK和基质金属蛋白酶9抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞迁移中的作用。结果与结论:Western blot结果证实,CREG蛋白表达在hVSMCs-CREG组中增加(P<0.05),而在hVSMCs-siCREG组中减少(P<0.05)。刮伤实验和Transwell实验分析结果证实hVSMCs-CREG组细胞较正常对照组细胞迁移能力受抑。相反,hVSMCs-siCREG组细胞迁移能力显著增加(P<0.05)。Western blot和明胶酶谱分析证实hVSMCs-siCREG组细胞中MMP9活性明显增加(P<0.05),同时JNK蛋白活化。进一步应用JNK抑制剂阻断研究证实,CREG蛋白表达抑制引起的血管平滑肌细胞迁移能力增加与细胞中基质金属蛋白酶9活性均受到剂量依赖性抑制。结果证实,CREG蛋白表达可抑制JNK-基质金属蛋白酶9信号通路的活化,以此抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移。; 闫承慧栾波李杰张效林韩雅玲; 关键词：阻遏蛋白 E1A激活基因阻遏子血管平滑肌细胞迁移

饮食钾缓解盐诱导的冠状动脉损伤被引量：6: 2014年; 目的:探讨饮食钾对盐诱导的冠状动脉损伤的保护机制。方法:将4周龄SD大鼠随机分为3组,每组10只,分别是对照组(NS,蒸馏水)、高盐组(HS,含1.5%NaCl蒸馏水)和高盐补钾组(HS+HP,含1.5%NaCl和0.5%KCl蒸馏水)干预16周。每2周监测各组大鼠尾动脉血压。干预16周后,硝酸还原酶法检测大鼠血清中NO的含量;硫代巴比妥酸法检测各组大鼠血清中丙二醛(MDA)的含量;HE染色观察各组大鼠左冠状动脉的大体形态;免疫荧光染色观察各组大鼠冠状动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达;二氢乙啶荧光探针染色/Western blotting法观察各组大鼠冠状动脉氧化应激的程度。结果:高盐干预16周后,高盐组大鼠根据尾动脉血压的变化分为盐敏感性大鼠和盐抵抗性大鼠。本实验只研究HS组中盐敏感性大鼠。在HS组中,大鼠血压较NS组显著升高,给予补钾后可以缓解血压的升高。HS组较NS组大鼠血清中NO降低,MDA升高,冠状动脉eNOS表达降低,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的gp91亚基表达升高,冠状动脉管壁厚度显著增加,且DHE荧光探针染色发现其超氧阴离子增加。高盐摄入的同时给予补钾可以缓解高盐摄入引起的有害效应。结论:高盐摄入通过氧化应激引起冠状动脉结构和功能的改变,补钾可以缓解这一效应的发生。; 张玉婕闫承慧朱男张效林赵昕韩雅玲; 关键词：钾冠状动脉内皮氧化性应激

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辽宁省科技厅科技攻关项目(2009225009-9)

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