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血浆GSTP1和SFRP1基因甲基化分析在肝细胞癌早期诊断中的价值被引量：6: 2011年; 背景与目的:DNA甲基化是一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。本研究运用自行建立的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法检测血浆GSTP1和SFRP1基因的DNA甲基化状态,探讨其在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)早期诊断中的价值。方法:收集150例血浆标本,包括72例HCC,37例肝良性病变和41名健康对照者。用MSRE-qPCR法检测血浆GSTP1和SFRP1基因DNA甲基化水平。结果:HCC患者血浆GSTP1和SFRP1甲基化阳性率分别为54.2%和27.8%,显著高于健康对照组(9.8%和2.4%,P<0.001)和肝良性病变组(10.8%和5.4%,P<0.001);同时检测血浆GSTP1和SFRP1可检出63.9%的HCC;而联合血清AFP分析可进一步将HCC诊断率提高至73.6%。结论:联合检测血浆GSTP1和SFRP1基因DNA甲基化对于HCC早期非侵入性诊断具有重要价值。; 王丰华东吴玉玉程之红胡瑜谢其根王琼瑶杜祥黄朝晖; 关键词：限制性内切酶肝细胞癌血浆

MSRE-qPCR技术分析多基因DNA甲基化对肝细胞癌的诊断价值被引量：18: 2011年; 背景与目的:DNA甲基化是潜在的肿瘤标志物。本研究运用自行建立的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法检测肝细胞癌(hepatocellutar carcinoma,HCC)组织中多个基因的DNA甲基化状态,筛选可用于HCC诊断的DNA甲基化标志物组合。方法:以47对HCC患者癌组织和癌旁组织、8例正常人肝组织为材料,运用MSRE-qPCR方法检测这102例肝组织中APC、GSTP1、RASSF1A、p16、SFRP1、RUNX3、Hint1、SOCS1和HIC-1基因的启动子甲基化状态。结果:APC、GSTP1、RASSF1A、p16、SFRP1、RUNX3基因在肿瘤组织中的甲基化率分别为70.2%、70.2%、63.8%、29.8%、44.7%和36.2%,均显著高于对应癌旁组织(P均<0.05);而Hint1、SOCS1和HIC-1基因甲基化水平在HCC肿瘤和癌旁组织间无显著差异。联合检测APC、GSTP1、RASSF1A和SFRP1 4个靶点,可检出所有HCC病例。这些基因的甲基化水平与患者肿瘤大小、分化、包膜及HBV感染等临床病理参数均无显著相关性。结论:联合检测APC、GSTP1、RASSF1A和SFRP1的DNA甲基化状态对于HCC风险评估和分子诊断具有重要价值。; 邱东民余坚黄朝晖; 关键词：DNA甲基化限制性内切酶肝细胞癌

Stat3 mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达被引量：1: 2011年; 目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3(Stat3mRNA)的微小RNA(MicroRNA)表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为:76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为:73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为:89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义(均P<0.01)。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。; 张勇李德春郭子健戴赛民黄朝晖朱东明; 关键词：信号转导和转录激活因子3 微小RNA RNA干扰重组质粒

甲基化敏感限制酶结合定量PCR检测DNA甲基化方法的建立与应用被引量：4: 2011年; 启动子CpG岛高甲基化是抑癌基因失活的重要机制之一，对于肿瘤的早期诊断、分子分型、预后判断等均具有较大的价值。目前较常用的DNA甲基化检测技术是基于亚硫酸氢盐处理的甲基化特异PCR方法（MSP），但该技术需使用强碱对DNA进行处理，导致绝大多数DNA分子发生断链。限制性内切酶广泛应用于DNA甲基化分析，其中甲基化敏感性限制内切酶（MSRE）只能切割非甲基化的靶位点；; 黄朝晖吴玉玉华东胡瑜王丰程之红余坚杜祥; 关键词：DNA甲基化定量PCR检测限制酶限制性内切酶

血浆Ras相关区域家族蛋白1A基因甲基化在肝细胞癌分子诊断中的价值被引量：5: 2011年; 目的:建立一种可检测微量DNA标本中DNA甲基化的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法,并运用该技术探讨血浆Ras相关区域家族蛋白1A(Ras association domain family1A,RASSF1A)基因甲基化检测在肝细胞癌(hepatocellutar carcinoma,HCC)非侵入性诊断中的价值。方法:用MSRE HhaⅠ消化DNA样品,再用qPCR技术分析酶切结果,建立检测RASSF1A基因甲基化的MSRE-qPCR方法。以45例肝组织(20对HCC患者手术切除肿瘤标本及匹配非癌组织和5例正常肝)为材料,测试该方法的应用价值;运用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulf ite sequencing PCR,BSP)技术进行进一步验证,并与甲基化特异性PCR(methylation specif ic PCR,MSP)方法相比较。再运用该技术检测150例血浆标本(包括72例HCC患者、37例肝硬化或慢性肝炎等良性病变患者和41例健康对照)的RASSF1A基因甲基化状态,并分析其与HCC患者临床病理参数的关系。结果:MSRE-qPCR法可定量检测低至1%以下的RASSF1A甲基化片段。20例HCC组织中有14例(70%)发生RASSF1A高甲基化,对应非癌组织中RASSF1A甲基化阳性率为25%,而5例正常肝组织均为阴性。MSRE-qPCR结果经BSP验证无误,且与MSP检测结果具有较好的一致性。HCC患者血浆RASSF1A甲基化阳性率(47/72,65.3%)显著高于健康对照(1/41,2.4%)和肝良性病变组(3/37,8.1%),差异均有统计学意义(P<0.0001)。联合检测血浆RASSF1A甲基化与血清AFP可显著提高HCC诊断效率。结论:建立的MSRE-qPCR方法要求样本少、操作简便、成本低廉,可定量检测RASSF1A基因甲基化水平。血浆RASSF1A甲基化分析对于HCC的非侵入性诊断具有重要价值。; 费伯健黄朝晖华东胡瑜程之红余坚; 关键词：DNA甲基化血浆分子诊断技术限制性内切酶

腺瘤性结肠息肉病基因甲基化在肝细胞癌分子诊断中的价值被引量：1: 2011年; 目的:建立甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzyme-quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法,并应用该方法探讨血浆腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因甲基化检测在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)诊断中的应用价值。方法:用HhaⅠ消化DNA样品,qPCR技术评估酶切效率,建立优化的MSRE-qPCR方法。用MSRE-qPCR法检测45例肝组织(20例HCC及其相应匹配的非癌组织和5例正常肝组织)中APC甲基化水平;应用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfi te sequencing PCR,BSP)对MSRE-qPCR检测结果进行验证,并与甲基化特异性PCR(methylation-specifi c PCR,MSP)检测方法比较。运用MSRE-qPCR技术检测72例HCC、37例肝良性病变和41例健康志愿者血浆标本的APC甲基化状态。结果:建立的MSRE-qPCR方法可定量检测低至1%的APC甲基化片段。MSRE-qPCR和MSP检测结果均显示,HCC组织中APC基因发生高频率甲基化。MSRE-qPCR检测结果经BSP验证准确无误,且与MSP检测结果具有较好的一致性(Kappa=0.955,P<0.0001)。HCC患者血浆APC甲基化水平高于肝良性病变及健康志愿者(P<0.0001)。血浆APC甲基化分析与血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)联合检测可提高HCC诊断效率。结论:MSRE-qPCR可定量检测APC甲基化水平。血浆APC甲基化分析对于HCC的非侵入性诊断具有重要价值。; 胡瑜华东程之红吴玉玉谢其根王琼瑶余坚黄朝晖; 关键词：DNA甲基化分子诊断技术聚合酶链反应限制性内切酶基因

DNA甲基化在肿瘤无创性分子诊断中的研究进展被引量：3: 2009年; DNA甲基化是真核细胞基因组最常见的一种表观遗传学修饰。DNA甲基化异常在肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色。研究显示DNA甲基化是一类潜力很大的肿瘤标志物。肿瘤特异性的DNA甲基化标志物可从肿瘤患者血清/血浆、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液中检出,为进行肿瘤无创性诊断DNA甲基化检测提供了新思路。本文对DNA甲基化在恶性肿瘤早期诊断的研究进展作一综述。; 黄朝晖杜祥; 关键词：DNA甲基化表观遗传学循环DNA 粪便

定量PCR检测肝细胞癌患者血浆循环DNA及其临床意义被引量：9: 2010年; 背景与目的:血循环DNA是一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。本研究运用定量PCR技术检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血浆循环DNA含量并探讨其诊断价值。方法:收集72例HCC患者术前血浆样本,37例肝良性病变(肝硬化以及慢性肝炎)和41例健康志愿者的血浆样本,纯化血浆循环DNA,采用实时定量PCR技术对血浆DNA水平进行检测。应用接受者操作特性(receiver-operating characteristics,ROC)曲线分析血浆循环DNA在HCC诊断中的价值。结果:HCC中位血浆循环DNA浓度(173ng/mL)显著高于健康对照(9ng/mL)和肝良性病变组(46ng/mL)(P<0.001);其ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)分别为0.949和0.874。而HCC血浆DNA浓度也显著高于肝硬化及慢性肝炎患者(P=0.001),AUC为0.703。以18.2ng/mL作为诊断HCC的临界值,其诊断特异度为90.2%,敏感度达90.3%;与血清AFP联合检测可提高HCC诊断效率,AUC上升至0.974,其诊断特异度和敏感度分别为95.1%和94.4%。伴肝内播散或脉管癌栓HCC患者的血浆DNA浓度(261ng/mL)明显高于不伴肝内播散灶或脉管癌栓患者(142ng/mL,P=0.035)。结论:定量PCR技术可精确定量血浆循环DNA浓度;血浆DNA分析对于HCC诊断,预测肿瘤转移潜能具有重要价值。; 黄朝晖胡瑜华东程之红谢其根王琼瑶王丰周锡科杜祥; 关键词：肝细胞癌血浆定量PCR 循环DNA

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江苏省自然科学基金(BK2008114)

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