国家自然科学基金(30772364)
- 作品数：11 被引量：24H指数：3
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- 相关机构：南京医科大学南京医科大学第二附属医院南京军区南京总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- STEAP4基因在人前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达被引量：3
- 2010年
- 目的观察人肥胖相关全长新基因STEAP4在人前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨STEAP4基因与脂肪细胞分化、脂质积聚的关系。方法体外培养人前体脂肪细胞,待细胞生长融合后以1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及罗格列酮联合诱导方案,在体外诱导其分化为成熟脂肪细胞。在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中观察细胞形态及脂质积聚变化;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(前体,第0、4、6、8、11、14、17天)脂肪细胞中STEAP4基因mRNA的表达水平。结果STEAP4基因高表达于人前体脂肪细胞;加入脂肪细胞分化诱导剂后(第4天)表达略有上调,其后随脂肪细胞分化成熟该基因表达量呈逐渐下降趋势;至脂肪细胞完全分化成熟(第14-17天)表达量最低。STEAP4基因表达水平除在诱导分化前至第4天、第14-17天差异无统计学意义外,余各时间点的表达水平差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论STEAP4基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调,可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖的发生有关。
- 陈小慧赵亚萍高春林张春梅朱春朱金改郭锡熔
- 关键词：分化
- 新基因6次跨膜表位抗原4在肥胖患儿脂肪组织的表达及生物信息学分析被引量：3
- 2011年
- 目的肥胖呈现全球流行趋势。目前,已基本证实其为一种多基因遗传病,先前研究小组筛选获得肥胖相关的新基因6次跨膜表位抗原(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 4,STEAP4)在肥胖患儿脂肪组织中差异表达,旨在进一步验证其在肥胖儿童脂肪组织中的表达,并初步探讨STEAP4的生物信息学特征。方法采用实时荧光定量PCR(Realtime-qPCR)技术验证肥胖与健康儿童脂肪组织中STEAP4基因的表达差异,应用DNA Star、Blast、ProtParam、SOPMA、Tar-getP、TMHMM、ProtScale、Interpro Scan和SMART等软件或数据库分析STEAP4的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、结构域及亚细胞定位等。结果 STEAP4基因是一个功能未知的基因,低表达于肥胖患儿脂肪组织中,生物信息学分析该基因cDNA全长4454 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长1380 bp,编码459个氨基酸,预测相对分子质量51981.2,定位在胞膜,蛋白序列分析显示为6次跨膜螺旋结构,为可溶的亲水性蛋白,蛋白结构域分析显示具有黄素蛋白跨膜成分(三铁还原酶结构域),NAD(P)结合结构域,NADP氧化还原酶(依赖辅酶F420)和血红素蛋白保守位点。结论 STEAP4基因是一低表达于肥胖患儿脂肪组织中的基因,高度提示该蛋白与肥胖及其相关的胰岛素抵抗的发生存在相关性,值得进一步研究证实。
- 高春林刘光陵夏正坤邱洁高远赋樊忠民伏洁任献国徐敏郭锡熔
- 关键词：计算生物学
- 抗STEAP4多克隆抗体的制备、纯化和鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的制备兔抗人STEAP4多克隆抗体及其特性鉴定。方法应用DNAStar软件对STEAP4的蛋白序列进行分析,选择STEAP4基因编码蛋白的近N端序列合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)交联。以纯化的STEAP4免疫新西兰白兔,制备抗STEAP4蛋白多抗,间接ELISA检测兔血清效价,Westernblot和免疫组织化学法鉴定多抗的特异性。结果得到兔抗人STEAP4多肽抗体,效价达16000。ELISA及蛋白印迹证实兔抗人STEAP4抗体可特异性识别STEAP4多肽。Westernblot结果显示该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为52000。以一抗采用STEAP4多克隆抗体的脂肪组织石蜡切片为检测标本,进行STEAP4组织定位研究,发现STEAP4蛋白表达于脂肪细胞膜;以上结果皆与STEAP4的生物信息学分析一致。结论成功制备了抗STEAP4多克隆抗体,制备的兔抗人STEAP4合成肽抗体可应用于Westernblot和免疫组织化学试验,为后续深入研究STEAP4蛋白的功能奠定了基础。
- 朱春季晨博邱洁张春梅倪毓辉刘峰陈晓慧朱金改费莉郭锡熔
- 关键词：多克隆抗体蛋白印迹
- STEAP4基因蛋白铁氧化还原酶活性分析被引量：1
- 2011年
- 目的分析肥胖相关基因STEAP4的铁氧化还原酶活性。方法体外温箱培养昆虫细胞株(Sf9),分别将pAcSec1-STEAP4转移载体和pAcSec1-vector转移载体与SapphireTM杆状病毒基因组混合后共转染Sf9昆虫细胞,通过G418药物筛选稳定表达STEAP4蛋白的细胞株,并抽提细胞总蛋白进一步应用Western blot技术验证其转染情况。应用分光光度计法检测铁氧化还原酶活性。应用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果 Western blot技术证实STEAP4过表达细胞株构建成功;分光光度计法检测STEAP4铁氧化还原酶活性,STEAP4过表达组A值为5.182 5±0.230 4,空载组A值为1.615 0±0.822 6,STEAP4过表达组铁氧化还原酶活性明显高于空载组,差异有统计学意义(Pa<0.001)。结论 STEAP4基因蛋白具有铁氧化还原酶活性。
- 秦大妮季晨博张春梅史春梅朱冠忠郭锡熔
- 关键词：肥胖
- STEAP4抗体干预对人前体脂肪细胞内活性氧、线粒体膜电位的影响被引量：3
- 2010年
- 目的探讨STEAP4抗体干预对人前体脂肪细胞内活性氧(ROS)、线粒体膜电位的影响。方法应用锥虫蓝活性试验对细胞活性进行检测,并进一步确定STEAP4抗体原液按1:250的比例稀释。体外培养人前体脂肪细胞,应用质量浓度为0.5g.L-1的STEAP4抗体,按1:250的比例稀释后(即质量浓度为0.125g.L-1)干预人前体脂肪细胞。应用激光共聚焦显微镜拍照,定性、定量分析ROS、线粒体膜电位变化。结果 STEAP4抗体按1:250比例稀释作用于人前体脂肪细胞后,可显著降低细胞活性;人前体脂肪细胞在STEAP4抗体按1:250稀释浓度干预下,细胞内ROS水平显著增加、线粒体膜电位水平显著降低,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论 STEAP4抗体按1:250比例稀释后,作用于人前体脂肪细胞后可显著提高ROS水平、降低其线粒体膜电位,推测STEAP4基因影响胰岛素敏感性的机制可能涉及线粒体功能变化。
- 秦大妮季晨博朱春寇春兆朱金改郭锡熔
- 关键词：活性氧膜电位
- STEAP4蛋白在人脂肪组织中表达大小的验证被引量：1
- 2010年
- 目的采用STEAP4多克隆抗体对其在人脂肪组织中的表达大小进行验证。方法 6例阑尾炎手术患儿中随机选取3例患儿的脂肪组织标本,抽提总蛋白,应用本实验室自制的STEAPG蛋白多克隆抗体,采用Westernblot技术检测STEAP4蛋白在人脂肪组织中表达的大小。结果目的条带出现于蛋白Marker相对分子质量55000以下位置,与STEAP4蛋白预测相对分子质量52000基本相符。结论本实验室自制的STEAP4蛋白多克隆抗体具有良好的免疫学活性,能够满足STEAP4免疫印迹检测的实验要求。STEAP4蛋白在人脂肪组织中的相对分子质量约为52000,为后续深入研究STEAP4蛋白的功能奠定了基础。
- 邱洁周晓玉程锐王玢朱春朱金改郭锡熔
- 关键词：肥胖
- 轻度维生素A缺乏对大鼠肺发育中肺组织血小板源性生长因子A表达的影响被引量：4
- 2011年
- 目的观察轻度维生素A缺乏(MVAD)对大鼠肺发育中血小板源性生长因子A(PDGF-A)表达的影响。方法 32只清洁级SD大鼠,雌雄各半。雌鼠随机分为MVAD组(n=10)和对照组(n=6)。MVAD组喂养维生素A(VitA)缺乏饲料,对照组喂养正常饲料。3周后雌雄鼠交配,建立MVAD孕鼠模型。高效液相色谱法检测2组雌鼠血清VitA水平和孕20 d胎鼠肝脏VitA水平;测量出生1 d乳鼠身长、尾长、体质量;取MVAD组和对照组出生1 d乳鼠肺组织,反转录(RT)-PCR方法检测出生1 d乳鼠肺脏PDGF-A mRNA的表达,免疫组织化学方法检测其PDGF-A蛋白的表达水平。应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果 MVAD组雌鼠毛色干枯,少食少动,孕鼠部分流产不孕。MVAD组雌鼠血清VitA水平显著低于对照组(P<0.05)。MVAD组孕20 d胎鼠肝脏VitA水平亦显低于对照组(P<0.05)。MVAD组出生1 d乳鼠身高、尾长及体质量数值均低于对照组(Pa<0.05)。MVAD组出生1 d乳鼠肺组织PDGF-A mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);免疫组织化学检测出生1 d乳鼠肺组织支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞内均可见PDGF-A蛋白表达,MVAD组PDGF-A蛋白表达量较对照组少(P<0.05)。结论 VitA在肺发育中起重要作用,MVAD引起PDGF-A的表达减少,可能是大鼠肺发育障碍的原因之一。
- 许春阳郭锡熔叶宏伟冯玉峰张劲松
- 关键词：肺发育高效液相色谱法
- 肿瘤坏死因子-α对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响及其机制
- 2011年
- 目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响,并分析其可能的机制。方法应用1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、地塞米松、胰岛素、罗格列酮方案诱导人前体脂肪细胞分化,以人重组TNF-α或加用细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)抑制剂PD-98059干预人成熟脂肪细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞膜蛋白与总蛋白中STEAP4蛋白的表达。结果 TNF-α干预能显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白向细胞膜转位;ERK抑制剂PD-98059联合TNF-α与单独应用TNF-α诱导人成熟脂肪细胞的细胞膜蛋白和总蛋白中STEAP4蛋白的表达水平比较均无显著差异。结论 TNF-α干预显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的膜转位,初步排除丝裂原活化蛋白激酶信号途径参与这一调控机制。
- 邱洁周晓玉程锐季晨博秦大妮郭锡熔
- 关键词：肥胖肿瘤坏死因子-A
- TNFα对人脂肪细胞STEAP4基因表达的调控
- 2009年
- 目的人STEAP4基因是一个参与胰岛素敏感性调节的肥胖相关差异表达基因,本研究旨在探讨胰岛素抵抗相关脂源性细胞因子TNFα对人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的调节作用。方法体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用不同浓度(0、5、10、25、50ng/mL)人重组TNFα干预成熟脂肪细胞24h,采用实时荧光定量RT-PCR技术、Western blot技术检测干预后人成熟脂肪细胞STEAP4基因在核酸和蛋白表达水平的变化。结果不同浓度TNFα(5、10、25、50ng/mL)干预24h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的mRNA表达,与未干预对照组差异有显著性(P<0.05);50ng/mLTNFα干预时STEAP4基因在人成熟脂肪细胞中的mRNA表达水平最高。与基因表达结果相一致,不同浓度TNFα(5、10、25、50ng/mL)干预24h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的表达,与未干预对照组差异有显著性(P<0.05);干预浓度提高到25ng/mL时干预效果最为明显。结论TNFα能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因核酸和蛋白的表达。
- 陈小慧赵亚萍朱春季晨博张春梅朱金改高春林郭锡熔
- 关键词：细胞分化肿瘤坏死因子
- 高糖对原代培养人脂肪细胞线粒体膜电位及胰岛素敏感性的影响被引量：3
- 2010年
- 目的肥胖及其相关的2型糖尿病已经成为重要的公众健康问题,而胰岛素抵抗是其重要特点,尽管已经有众多的研究,但胰岛素抵抗发生的机制仍不清楚。文中研究高糖对原代人脂肪细胞线粒体膜电位及胰岛素敏感性的影响。方法取疝气手术的成人腹部皮下脂肪组织,Ⅱ型胶原酶消化分离人脂肪细胞,锥虫蓝染色方法鉴定细胞活力;高糖(25mmol/L)和低糖(5 mmol/L)的DMEM完全培养基培养24 h,3H-2-D-葡萄糖摄取实验验证胰岛素敏感性,经mitotracker red染色,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化。结果Ⅱ型胶原酶消化法分离的人脂肪细胞活力良好,经锥虫蓝染色法显示细胞存活达到100%。线粒体膜电位检测结果显示,在激光共聚焦显微镜下,高糖组人脂肪细胞的荧光强度较低糖组细胞明显降低;流式细胞仪检测结果显示低糖组荧光值为28.54±2.25,高糖组荧光值为10.78±0.99,差别显著,P<0.01。高糖组和低糖组基础葡萄糖摄取无差异,分别为:7808.2±1920.4,6833.2±1408.6,胰岛素刺激后的葡萄糖摄取2组均增加,低糖组27111.4±3363.3,高糖组14135.9±4140.9,低糖组胰岛素刺激的葡萄糖摄取量与基础葡萄糖摄取量的比值为2.75±0.44,高糖组为1.67±0.13,差别显著,P<0.05。结论髙糖显著降低人脂肪细胞线粒体膜电位,同时下调胰岛素敏感性。
- 高春林赵亚萍陈小慧季晨博张春梅朱春朱金改郭锡熔
- 关键词：原代培养线粒体膜电位
