国家自然科学基金(30872358)
- 作品数：7 被引量：14H指数：3
- 相关作者：马越云郝晓柯周珊刘家云郭旭光更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院广州医学院第三附属医院第四军医大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究被引量：1
- 2011年
- 目的制备天然和重组肝素结合血凝素(HBHA)蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗(BCG)培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。
- 周珊徐修礼马越云刘家云樊新孙怡群郝晓柯
- 关键词：多克隆抗体结核分枝杆菌
- 重组和天然HBHA蛋白制备及其活性研究被引量：7
- 2010年
- 目的制备天然和重组HBHA蛋白，并比较其诱导产生的抗体对其聚集BCG活性的抑制效应。方法将7H9液体培养基中的BCG培养至稳定生长期，用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白（nHBHA）。同时，克隆HBHA基因片段，表达于大肠杆菌BL-21中，经亲和层析法纯化蛋白，并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。在BCG的液体培养基中分别加入不同浓度的HBHA蛋白，观察菌体的聚集情况。同时，用抗HBHA抗体与HBHA蛋白孵育后，加入BCG培养基中，观察菌体聚集情况。结果获得天然HBHA蛋白纯度为99％，浓度为1．016mg／mL重组蛋白表达量约占菌体蛋白总量的36％，纯化得到纯度为97．1％，浓度为10．98mg／m]的重组HBHA蛋白。所得天然和重组蛋白均有诱导BCG聚集的作用，当nHBHA浓度为0．2μg/ml时BCG出现少量聚集，而rHBHA浓度达到2μg／ml时BCG才出现聚集。并且此聚集现象均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白；证实了两者均具有促进BCG聚集的功能，并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断和疫苗价值提供了实验依据。
- 周珊马越云刘家云苏明权张海师长宏王丽华郭旭光郝晓柯
- 关键词：抗体
- 肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制被引量：3
- 2011年
- 目的:构建Atg5-真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法:设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3.1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞,通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果:成功的构建了pSilencerTM 3.1-H1 hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论:在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。
- 郭旭光夏勇马越云郝晓柯
- 关键词：自噬自噬体结核分枝杆菌肺泡上皮细胞
- 肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力
- 2014年
- 目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。
- 郑青杨柳杨静周珊周磊韩若冰郝晓柯马越云
- 关键词：RMS肝素结合血凝素A549细胞LC3耻垢分枝杆菌
- HPV基因分型检测在宫颈癌筛查中的应用被引量：1
- 2012年
- 目的:探讨人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)基因分型技术在宫颈癌筛查中的临床应用价值。方法:采用反向斑点杂交法对HPV基因型进行分析,包括低危型(如6、11、42、43、44型等)和高危型(如16、18、31、33、35、MM4型等)共23个型别。结果:98例样本中检出HPV阳性者38例,23种基因型中共检出15种HPV型别,HPV总感染率38.8%(38/98)。慢性宫颈炎患者中HPV感染率30.4%(14/46),检测到的HPV亚型主要是HPV43,11,6,42,31和51(其中HPV6,42,31,51检出率一致)。CINI患者HPV感染率15.4%(4/26),最常见的HPV亚型为HPV35,其次为HPV16,52,53和59(其中16,52,53,59检出率一致)。CINⅡ患者HPV感染率71.4%(10/14),以HPV16,6,11,51等亚型最常见。CINⅢ患者HPV感染率75%(6/8),HPV亚型以HPV16,18,31,53为主。SCC患者HPV阳性率为100%(4/4),HPV16检测率最高,其次为HPV52,18,33,58,59和66。结论:持续的HPV感染与宫颈疾病有着密切的关系。HPV基因型的检测为临床进行宫颈疾病的筛查、诊断、治疗以及预后观察提供了较大的帮助。
- 肖凤静苏明权杨柳马越云郝晓柯
- 关键词：人乳头瘤病毒基因分型反向斑点杂交宫颈癌
- 肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与结核分枝杆菌相互作用的研究被引量：4
- 2010年
- 目的:检测LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞A549上的表达情况,及结核分枝杆菌刺激后对其表达的影响,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中所起的作用。方法:体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,在结核分枝杆菌感染A549细胞0h,24h分别提取RNA,采用RT-PCR的方法检测LC3mRNA的表达情况。采用凋亡坏死染色试剂盒在结核分枝杆菌感染24h后检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组的细胞坏死情况。在结核分枝杆菌感染A549细胞4h,8h,16,24h采用Non-Radioactive Cytocity Assay的方法检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值。结果:LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞显著表达,结核分枝杆菌感染后LC3表达降低。细胞凋亡和坏死染色结果显示空白组和3-MA组没有明显差异(P>0.05),MTB组和3-MA+MTB组有明显差异(P<0.05)。LDH检测显示MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值数据两两之间有明显差异(P<0.05)并且有时间依赖性。结论:肺泡II型上皮细胞自噬体在抵抗结核分枝杆菌的感染过程中起一定的作用。
- 郭旭光马越云周珊刘家云苏明权郝晓柯
- 关键词：LC3结核分枝杆菌自噬体
- HBHA截短体蛋白的表达纯化及其诊断活性研究
- 2014年
- 目的原核表达HBHAΔC及HBHAΔN蛋白,比较HBHA系列蛋白活性。为进一步研究HBHA临床诊断价值提供实验依据。方法克隆HBHAΔC和HBHAΔN目的基因,用于大肠杆菌(E.coli)BL-21系统表达纯化。将蛋白通过CL-6B柱检测肝素结合能力。并加入到培养BCG的7H9液体培养基中,观察其诱导BCG聚集情况。结果nHBHA,rHBHA及HBHAΔN蛋白均具有肝素结合能力。nHBHA、rHBHA和HBHAΔC蛋白具备诱导BCG聚集的作用。结论成功获得HBHA截短体蛋白;证实HBHA蛋白碳端参与肝素结合功能;蛋白氮端参与诱导BCG聚集反应。该实验结果为进一步研究TB感染分子机制及临床诊断应用奠定基础。
- 周珊徐修礼马越云刘家云程晓东张倩郝晓柯
- 关键词：结核分枝杆菌HBHA蛋白
