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猪圆环病毒2型全基因组的克隆及病毒拯救: 2018年; 为构建猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型(PCV2)感染性DNA克隆,以淋巴结病料组织中分离的PCV2细胞培养适应毒株为材料,通过基因序列分析比对,在PCV2基因组序列XbaⅠ酶切位点区设计重叠引物,进行全长扩增并克隆至pMD-18T和pBluescript SK,获得载体pMD-PCV2和pBluescript SK-PCV2。将pMDPCV2重组质粒大量扩增后,用XbaⅠ切出PCV2全基因组,在体外用T4DNA连接酶使其自环化。通过脂质体法将PCV2自环化产物转染至PK15细胞,并且经15次连续传代,分别用PCR、RT-PCR和间接免疫荧光测定(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测到PCV2的复制、转录和蛋白表达。该研究成功构建具有感染性的PCV2全基因组DNA,为PCV2致病机理和基因功能研究奠定基础。; 王紫凝高章照董沁芳全滟平姜永厚; 关键词：猪圆环病毒2型细胞转染病毒拯救

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析: 2015年; 对家蚕核型多角体病毒（Bm NPV）功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列（Gen Bank登录号：L33180.1）,选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1～49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。; 潘慧慧毕臻乐阿勇嘎王雨于威全滟平; 关键词：家蚕核型多角体病毒基因克隆原核表达亚细胞定位

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：5: 2014年; 猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，ORF4是PCV2中继ORF1，ORF2，ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386～565 nt），并克隆到pGEX-4T-1表达载体上，构建pGEX -4T-ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后，将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST-ORF4纯化，然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔，在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。 SDS-PAGE电泳检测结果表明，重组质粒成功表达了目的蛋白。 ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12800以上。 Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性，获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST-ORF4融合蛋白特异性反应。; 王净修高章照姜永厚吴海港饶品彬全滟平徐辉; 关键词：猪圆环病毒2型原核表达多克隆抗体

家蚕核型多角体病毒lef5基因对病毒基因组复制和转录调控的影响被引量：1: 2015年; lef5是杆状病毒的核心基因之一。构建家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef5基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid和补回型病毒lef5-re-Bacmid,研究lef5基因在BmNPV的基因组DNA复制及各时期基因转录调控中的作用。透射电子显微镜下观察lef5-ko-Bacmid转染BmN细胞后不能产生具有侵染活性的病毒粒子(BV)。荧光定量PCR(qPCR)发现lef5基因缺失对病毒基因组DNA的复制没有明显影响,但会导致病毒各时期基因的转录水平显著下降。进一步通过检测由BmNPV多角体蛋白基因(polh)启动子驱动的荧光素酶活性变化,明确lef5基因对polh基因启动子的调控作用,结果表明lef5基因对polh基因启动子有显著的正调控作用。研究结果提示,lef5基因缺失后不影响BmNPV基因组DNA的复制,但会影响病毒早期、晚期、极晚期基因的转录表达。; 余海鹏李俊张婷陈滨潘慧慧全滟平于威; 关键词：家蚕核型多角体病毒病毒复制基因转录

家蚕高迁移率蛋白的表达差异和亚细胞定位(英文): 2014年; 高迁移率蛋白A(high mobility group A,HMGA)与染色质重塑及癌症转移有密切关系。在胚胎期广泛表达,然而在成年期表达量很低,甚至不表达。以本实验室保存的家蚕蛹cDNA为模板,克隆家蚕高迁移率蛋白(Bombyx mori high mobility group A,BmHMGA)开放阅读框(345bp),构建重组质粒pET-28a(+)-BmHMGA,并在BL21Star(DE3)中正确表达融合蛋白His-BmHMGA。用Ni-NTA柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体;抗体效价1∶12 800以上,且具有较高特异性。实时荧光定量PCR检测结果表明:基因BmHMGA从卵、5龄幼虫、蛹到蛾,转录水平依次下降;在5龄幼虫期,BmHMGA基因的转录水平在头、表皮、卵巢、睾丸、脂肪体、气管、马氏管、丝腺和肠中从高到低分布。通过免疫印迹(Western blotting)法和酶联免疫法半定量分析结果显示。BmHMGA蛋白在家蚕卵中含量最高,蛾中最低;5龄幼虫头部的BmHMGA蛋白含量明显高于其他组织,中肠、马氏管中则没有明显的信号,与RT-PCR的结果基本一致。家蚕BmN细胞的免疫细胞化学实验结果显示,BmHMGA蛋白在细胞质中均匀分布。; 张海花赵燕张涵铭李司全艳萍于威张耀洲童富淡张晓娟; 关键词：家蚕亚细胞定位免疫细胞化学

稳定表达携带SFB标签的猪圆环病毒2型Cap蛋白细胞株的构建及其凋亡活性检测: 2017年; 为建立稳定表达携带SFB标签的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的细胞株并研究其诱导凋亡活性,本研究利用Gateway系统构建真核表达载体p DEST-SFB-ORF2,转染PK15细胞,嘌呤霉素抗性筛选,western blot和免疫共沉淀试验鉴定,获得2株稳定表达携带SFB标签的Cap蛋白的PK15细胞株。间接免疫荧光检测发现重组Cap蛋白在部分细胞内呈点状荧光分布,可能形成病毒性颗粒;流式细胞仪检测表明Cap蛋白的表达可诱导PK15细胞凋亡。本研究成功表达携带SFB标签的PCV2 Cap蛋白,并验证了其诱导凋亡活性,同时为下一步通过串联亲合纯化/质谱方法鉴定Cap蛋白的互作蛋白研究奠定基础。; 阿勇嘎徐霄于威姜永厚全滟平; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因 CAP蛋白

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立被引量：5: 2015年; 为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。; 吴海港饶品彬蔡晔全滟平姜永厚; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 TAQMAN探针

猪圆环病毒的基因密码子偏好性分析被引量：5: 2018年; 为了解不同型猪圆环病毒(PCV)(PCV1、PCV2、PCV3)的密码子使用特点及其主要影响因素,本研究通过生物信息学方法对3个型PCVs的rep和cap两个基因序列的密码子偏好性进行综合分析。结果显示3个型PCVs间、rep与cap两个基因间、PCVs与宿主间的密码子偏好性均存在明显差异。密码子适应指数(CAI)分析预示3个型PCVs的两个基因在宿主细胞中表达水平低。同义密码子的相对使用频率(RSCU)分析表明PCV1与PCV2具有相似的同义密码子使用模式,而PCV3与PCV1、PCV2存在明显差异,3个型PCVs与宿主的密码子偏好性也存在明显差异。rep基因偏好使用U或G结尾的同义密码子,cap基因偏好使用C结尾的同义密码子。通过中性绘图分析和ENC绘图分析显示,PCV的密码子使用模式受自然选择压力影响大,受突变压力的影响小。本研究为阐明PCV的分子进化规律及病毒对宿主翻译系统的适应性提供重要的实验依据。; 徐霄丁天宇于威姜永厚全滟平; 关键词：猪圆环病毒基因密码子偏好性生物信息学

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国家自然科学基金(31101831)

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