国家自然科学基金(31371280)
- 作品数：7 被引量：20H指数：2
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- 评价一种新CYP2C9突变型对药物代谢的影响
- 2019年
- 目的在体外表达细胞色素P2C9(32T> C),构建酶促反应体系,检测其对甲苯磺丁脲(tolbutamide)的代谢活性.方法利用定向诱变技术,以细胞色素P2C9野生型的互补DNA为反义链,获得细胞色素P2C9*3以及细胞色素P2C9(32T>C)的complementary DNA,利用杆状病毒穿梭载体bacmid抽提试剂盒获得bacmid,转染伪黏虫卵巢细胞,充分表达后提取微粒体蛋白质,并用免疫印迹法检测其表达量.在体外条件下,测定各型细胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲代谢的最大反应速率Vm和米氏常数Km,评价新突变体的催化功能.结果利用昆虫表达系统表达获得细胞色素P2C9 * 1、细胞色素P2C9*3和细胞色素P2C9(32T> C)3种微粒体蛋白质.免疫印迹结果显示,新变异型蛋白表达水平接近于野生型.体外代谢实验结果显示,细胞色素P2C9(32T> C)针对甲苯磺丁脲的体外清除率(Vm/Km)明显低于野生型,体外酶学活性为野生型的12.40%.结论在体外条件下,细胞色素P2C9(32T> C)对甲苯磺丁脲的代谢活性明显下降,提示携带有该基因型的患者服用细胞色素P2 C9的底物药时,体内代谢速率可能会有不同程度的降低,用药前需考虑调整剂量.
- 亢奋恒张博文戴大鹏李传宝蔡剑平
- 关键词：体外研究
- 中国汉族人群24种CYP2C19新突变体的体外活性研究被引量：2
- 2015年
- 目的以S-美芬妥英为探针药,体外分析24种汉族人群CYP2C19新变异体的酶学活性。方法以野生型CYP2C19 c DNA为模板,通过定点诱变方法获得24种CYP2C19新变异体和典型变异体CYP2C19.3的c DNA,利用Bac-toBac Baculovirus Expression System试剂盒,获得高表达各型CYP2C19变异体的昆虫微粒体。Western blot法进行CYP2C19蛋白定量。以S-美芬妥英为探针底物药,体外测定不同药物浓度下各型CYP2C19变异体的最大反应速率Vmax和米氏常数Km,评价新突变类型对CYP2C19体外代谢活性的影响。结果利用昆虫表达系统,成功获得高表达典型变异体CYP2C19.3和24种CYP2C19新变异体的昆虫微粒体。Western blot结果显示,变异体CYP2C19.3和35FS无正常CYP2C19酶的表达,与野生型相比,变异体CYP2C19.29和T130M表达量明显下降,其余变异体蛋白表达量与野生型接近。体外代谢实验结果显示,变异体L16F针对S-美芬妥英的体外清除率(Vmax/Km)较野生型升高,T130M的活性与野生型相似,其余各突变型的清除率均低于野生型。其中,突变体CYP2C19.3、35FS和R124Q对于该底物药无代谢活性。结论新发现的24种CYP2C19基因变异大多可引起酶体外药代活性显著降低,提示携带此类基因突变的个体服用经由CYP2C19代谢药物时,体内药物代谢速度可能会显著变慢,临床用药时需密切关注。
- 李传保戴大鹏蔡杰耿培武王双虎王豪胡国新蔡剑平
- 关键词：CYP2C19突变体体外研究
- 一种细胞内快速标记邻近蛋白复合物的新方法被引量：1
- 2020年
- 目的构建可诱导、细胞适用性广的细胞内快速标记邻近蛋白复合物新方法。方法体外合成TurboID编码基因,并与Tet-on系统一并插入改造后的慢病毒载体,病毒包装后侵染HeLa细胞以融合表达TurboID及目的蛋白YB1或对照蛋白GFP。使用不同浓度的强力霉素处理细胞24h以诱导融合蛋白的表达,加入50μmol/L生物素继续培养15~120min以使TurboID将临近蛋白进行生物素标记,免疫印迹法检测生物素标记的蛋白含量。结果成功构建了可诱导的TurboID融合表达慢病毒载体。获得的病毒侵染HeLa细胞,应用0.125μg/ml以上的强力霉素即可诱导细胞产生TurboID融合蛋白。生物素处理15min以上可得到大量生物素标记的蛋白。结论构建了快速标记邻近蛋白复合物的检测体系——TurboID系统,该系统具有可诱导、生物素标记迅速及细胞适用性广等优点,可广泛应用于大多数动物及人体细胞内蛋白复合物的筛查研究。
- 刘健周姗戴大鹏蔡剑平
- 关键词：蛋白复合物生物素化
- 指导中国汉族人群华法林用量预测方法的建立与评价被引量：15
- 2016年
- 目的建立一个指导中国汉族人群华法林用量的预测方法，并对其预测准确性进行验证。方法选取2012年5月至2014年12月在北京医院住院或门诊就诊的正在服用华法林抗凝的中国汉族患者512例，服药指征包括人工瓣膜置换术、心房颤动及肺栓塞。直接测序分析患者维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）和细胞色素P4502C9（CYP2C9）基因多态性（野生型、‘3型和’13型），记录患者人口统计学信息、华法林日服用量及合并使用胺碘酮情况；利用随机数字表法进行随机分组，从研究人群随机抽取384例作为建模组，剩余128例作为验证组。通过多元线性回归对建模组患者的数据进行分析，建立华法林稳定剂量预测方法；应用该方法对验证组患者的华法林稳定剂量进行预测，将结果与实际剂量进行比对，评价该方法的预测准确率。结果患者的年龄、体重、身高、VKORC1、CYP2C9基因型以及是否合并应用胺碘酮与华法林的稳定剂量相关，利用这几项变量建立的预测方法对于华法林稳定剂量的预测效果较好（R2=0．682，P〈0．01），VKORC1和CYP2C9基因多态性共解释了50％以上的剂量个体差异；验证组中62．5％（80／128）的患者预测剂量为理想预测剂量，7．81％（10／128）的患者预测剂量过低，29．69％（38／128）的患者预测剂量过高。结论本预测方法可用于指导中国汉族患者华法林稳定用药量的预测。
- 李传保戴大鹏胡国新普程伟曹亚坡蔡剑平
- 关键词：华法林遗传药理学
- 细胞色素P450 2C9新突变1400T＞C的发现及体外酶活性研究被引量：2
- 2013年
- 目的 明确1例华法林高敏感患者细胞色素P450 2C9酶（CYP2 C9）的新突变及其生物学功能.方法 提取患者基因组DNA,PCR产物利用直接测序法对CYP2C9、维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）及细胞色素P450 4F2酶（CYP4F2）基因进行序列测定,与国际数据库比对分析确定是否存在碱基突变.通过定点诱变方法获得3种典型缺陷型CYP2C9＊2、＊ 3、＊13及新突变型CYP2C9的cDNA,利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System试剂盒,获得高表达各型CYP2C9变异体的昆虫微粒体.Western印迹法进行CYP2C9蛋白定量,以甲苯磺丁脲为探针底物药,体外测定不同药物浓度下各型CYP2C9变异体的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）,评价新突变类型对CYP2C9体外代谢活性的影响.结果 患者CYP2C9基因中发现全新的突变类型：1400T＞C,可导致CYP2C9第467位氨基酸发生变异（L467P）,VKORC1及CYP4F2基因无碱基突变.体外代谢实验结果显示,突变体CYP2C9＊2、＊3、＊13和L467P的体外酶学活性分别为野生型的91.58％、13.55％、0.11％和1.59％.结论 1400T＞C突变可大大降低CYP2C9的体外酶学活性,提示携带此突变型的患者在使用经CYP2C9代谢的药物时,药物代谢速度会明显减慢,容易造成体内药物蓄积,发生潜在的药物不良反应.
- 戴大鹏李传保王双虎耿培武胡国新蔡剑平
- 关键词：细胞色素P450酶系统突变酶活性研究
- CYP2C9基因1300A〉T突变对体外药物代谢活性的影响被引量：1
- 2014年
- 华法林是目前临床常用的抗凝药物，自20世纪40年代合成以来，该药广泛应用于临床抗凝和抗血栓治疗，至今仍无有效的替代品出现。华法林的有效治疗范嗣较窄，不同个体间维持剂量存在很大的差异，用药不当会导致出血或血栓形成等严重不良事件的发生^[1-2]。近年来研究发现，基因多态性、药物相互作用及饮食等因素都会影响到华法林的临床药效，其中基因多态性是最重要的因素之一[^1-4]。
- 李传保戴大鹏王双虎耿培武胡国新蔡剑平
- 关键词：体外药物基因多态性突变临床药效药物相互作用抗凝药物
- CYP2C9*58型新突变体的体外酶学活性研究被引量：1
- 2013年
- 目的对CYP2C9基因新突变体(CYP2C9*58型)开展体外酶学功能研究,明确其代谢活性与野生型的相关性。方法以CYP2C9基因cDNA为模板,通过定点诱变方法获得CYP2C9各变异体的cDNA全长,用以构建昆虫表达载体。利用杆状病毒包装试剂盒包装昆虫病毒,侵染sf21昆虫细胞后获得高效表达CYP2C9各型蛋白的微粒体。以甲苯磺丁脲为探针底物药,利用获得的微粒体体外测定各变异体的最大反应速率V max和米氏常数K m,评价其主要酶促动力学特性。结果成功构建了CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型4种CYP2C9昆虫表达载体,Western blot证实该载体可用于稳定表达相应的CYP2C9突变体。CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型变异体的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的91.6%,13.5%和23.1%。结论 CYP2C9*58型的酶学活性较野生型明显降低,接近于典型缺陷型突变体CYP2C9*3型,提示携带此突变型的患者在服用经由CYP2C9代谢的相关药物时,药物代谢速度较野生型携带者会有一定程度的降低。
- 戴大鹏李传保王双虎耿培武胡国新蔡剑平
- 关键词：CYP2C9
