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原发性胆汁性肝硬化患者颗粒溶素的检测及意义: 2006年; 原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病，主要特征为肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤。颗粒溶素（granulysin，GNLY）是由自然杀伤细胞和激活的细胞毒性T淋巴细胞选择性表达的细胞毒分子。我们采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附法检测PBC患者外周血GNLY的表达，研究GNLY表达在PBC发病机制中的作用，为临床诊治提供依据。; 钱琤陈波周晔蒋廷旺吴传勇王燕谷明莉邓安梅仲人前; 关键词：颗粒溶素

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析被引量：7: 2006年; 目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定。方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性。结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性。结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础。; 钱琤陈孙孝周晔王燕谷明莉陈波陈燕邓安梅仲人前; 关键词：颗粒溶素基因表达生物学活性

原发性胆汁性肝硬化动物模型的建立及外周血T淋巴细胞表面CD_(40)配体分析被引量：2: 2007年; 目的用聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,PolyI:C)注射 C57BL/6小鼠以研究建立原发性胆汁性肝硬化(PBC)动物模型,探讨 CD_(40)配体(CD_(40)L)在外周血 T 淋巴细胞表面的表达,和在 PBC 中 T 淋巴细胞的活化情况。方法 20只 C57BL/6小鼠随机分对照组和模型组。将polyI:C 以5mg/kg 的剂量腹腔注射模型组小鼠,对照组注射 PBS,每周2次,120 d 后处死,留取外周血和肝组织,间接免疫荧光法检测血清抗线粒体抗体(AMA),HE 染色观察胆管病理变化,生化分析仪测定血清碱性磷酸酶(ALP)含量,流式细胞术分析外周血 CD_4^+、CD_8^+淋巴细胞所占比例及 CD_(40)L在 T 淋巴细胞表面的表达情况。结果 PolyI:C 注射120 d 后模型组小鼠均出现 AMA 阳性,肝组织小胆管周围有不同程度的炎性细胞浸润,血清 ALP 明显高于对照组(P<0.001);对照组胆管及血清ALP 均未发生明显变化;模型组小鼠 CD_(40)L^+/CD_4^+、CD_(40)L^+/CD_8^+T 淋巴细胞[(4.35±0.34)%,(1.42±0.10)%)显著高于对照组[(0.78±0.10)%,(0.43±0.04)%,P<0.01];而模型组小鼠 CD_4^+、CD_8^+T 淋巴细胞所占比例[(25.83±1.80)%,(2.4.84±2.70)%]与对照组[(20.51±3.46)%,(17.84±1.53)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PolyI:C 腹腔注射 C57BL/6小鼠120d 可引起 PBC 病变,活化的 CD_4^+、CD_8^+T 淋巴细胞在 PBC 发病中起重要作用。; 蒋廷旺邓安梅吴传勇张玲珍朱烨钱(五争)周晔谷明莉陈波仲人前; 关键词：肝硬化胆汁性动物 T淋巴细胞

自身抗原BCOADC-E2融合蛋白的重组表达和鉴定: 2006年; 周晔姚定康陈燕朱烨蒋廷旺吴传勇钱琤邓安梅仲人前; 关键词：融合蛋白纯化鉴定自身抗原原发性胆汁性肝硬化抗线粒体抗体

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体基因表达水平被引量：3: 2005年; 目的研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体(BAFF-R)含量的方法,及探讨其在外周血单个核细胞(PBMC)中BAFF-R mRNA表达的检测价值.方法在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针,用逆转录(RT-PCR)扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BAFF-R mRNA含量,并以 BAFF-R mRNA和β2M mRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价.结果 RFQ -PCR检测BAFF-R含量的线性范围为109 ～101 pg/ml,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为12.5%和11.9%,高浓度样本批内和批间CV分别为8.3%和9.3%.30名健康献血员样本的PBMC中,83%(25/30)有BAFF-R mRNA表达,范围为0.14～1.03.结论 RFQ -PCR检测BAFF-R mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性.; 鞠少卿张冬雷倪红兵王跃国苏建友施健王惠民孔宪涛仲人前; 关键词：实时荧光定量 B细胞 MRNA表达 PBMC

原发性胆汁性肝硬化患者外周血颗粒溶素表达增高及其意义被引量：2: 2007年; 目的探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)中外周血颗粒溶素的表达及意义。方法用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测60例PBC患者颗粒溶素的 mRNA表达,用ELISA法检测血清中颗粒溶素水平,以100例体检健康者、80例肝炎后肝硬化患者和80例SLE患者为对照组。结果PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中颗粒溶素 mRNA的平均拷贝数(2.8±1.9)×108高于肝炎后肝硬化患者(5.6±2.9)×106、SLE患者(9.5±2.4)×106和体检健康者(2.5±1.4)×106(P<0.01)。血清中颗粒溶素的水平为(16.12±2.24)ng/ml,也显著高于体检健康者、肝炎后肝硬化患者、SLE患者。结论FQ-PCR法检测颗粒溶素的 mRNA水平及ELISA方法检测血清中颗粒溶素的浓度,有助于了解PBC患者体内免疫状态,为临床诊治和研究提供依据。; 陈燕周晔姚定康蒋天舒谷明莉朱樑仲人前邓安梅; 关键词：原发性胆汁性肝硬化颗粒溶素荧光定量聚合酶链反应酶联免疫吸附试验

颗粒溶素对NK细胞和树突状细胞具有化学趋化作用研究: 2007年; 陈燕娄加陶钱琤周晔陈波张玲珍蒋天舒谷明莉仲人前邓安梅; 关键词：树突状细胞 NK细胞颗粒溶素趋化作用细胞毒性T淋巴细胞氨基酸序列分析

血清BLyS和APRIL水平与非霍奇金氏病关联性的初步研究被引量：1: 2007年; 目的:研究非霍奇金氏病(NHL)患者血清B淋巴细胞刺激因子(BLyS)和增殖诱导配体(APRIL)蛋白水平,并探讨其与血清乳酸脱氢酶(LDH)的关系。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测LDH升高患者组(10例)和LDH正常NHL患者组(12例)NHL患者血清BLyS和APRIL水平,以健康志愿者(23例)作为对照;同时将血清BLyS和APRIL水平与患者血清乳酸脱氢酶(LDH)进行相关性分析。结果:NHL患者组血清BLyS水平显著低于健康对照组(P<0.05);NHL患者血清APRIL水平与健康对照组无显著性差异(P>0.05),但LDH升高患者组血清APRIL水平明显高于LDH正常患者组(P<0.05);NHL患者组和LDH升高患者组血清APRIL水平与LDH正相关(r=0.923、0.799,P<0.05)。结论:NHL患者血清BLyS、APRIL水平与健康对照组差异,提示BLyS和APRIL可能与NHL的预后及恶性程度有关。; 鞠少卿倪红兵王跃国张芹黄一红周锦红刘才旺孔宪涛仲人前; 关键词：B淋巴细胞刺激因子增殖诱导配体乳酸脱氢酶

颗粒溶素对U937细胞分泌MCP-1、RANTES与TNF-α功能的影响被引量：1: 2008年; 目的探讨颗粒溶素对U937细胞分泌MCP-1、RANTES与TNF-α功能的影响。方法①在U937细胞中加入终浓度为100ng/ml的乙酰肉豆蔻佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA),刺激2d后,再加入不同组合的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄球菌的脂膜酸(lipoteichoic acid,LTA)、颗粒溶素(granulysin,GNLY),刺激培养4h后收集细胞上清,用ELISA检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的含量。②在U937细胞或原代单核细胞中加入GNLY后,在37℃条件下,刺激4h,收集上清,以ELISA分析MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1,单核细胞趋化因子-1)和RANTES(reduced upon activation normal Texpression and secreted,正常T细胞活化时表达和分泌减少因子)的含量;收集细胞并抽提总RNA后,以实时荧光定量RT-PCR方法检测部分基因表达水平的改变。结果加入GNLY后,LPS诱导U937细胞分泌的TNF-α水平显著增加(P<0.05);U937细胞或单核细胞的MCP-1、RANTES的mRNA水平显著增加(P<0.05),上清液中MCP-1和RANTES水平也增加(P<0.05)。结论GNLY可促进LPS诱导单核细胞分泌TNF-α,本身可刺激单核细胞表达MCP-1、RANTES增高,这为以后进一步研究颗粒溶素的作用机制打下了基础。; 黄东标胡晓燕钱琤陈燕周晔陈波邓安梅仲人前; 关键词：颗粒溶素单核细胞单核细胞趋化因子-1

隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体重组表达及鉴定: 2008年; 目的重组表达隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体,以进一步探讨其免疫效应。方法选取隐球菌抗原表位GMFDGLSGV,引入Th表位PADRE及木马肽序列(RKKRRQRRR),并以RVKR序列作为接头,分别合成隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列,经PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠埃希氏菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果成功构建了隐球菌保护性表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为32000,36000,42000的融合蛋白。结论隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的重组表达为进一步开发隐球菌疫苗提供有价值的依据。; 谷明莉钱琤周晔陈波陈孙孝邓安梅仲人前; 关键词：隐球菌

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上海市重大科技攻关项目(04DZ19116)

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