“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD06A13-4)
- 作品数：5 被引量：42H指数：3
- 相关作者：李刚李伟史利军范晓娟张锦秀更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所海西州动物疫病预防控制中心更多>>
- 发文基金：“十一五”国家科技支撑计划引进国际先进农业科技计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 快速检测小反刍兽疫病毒RT-LAMP方法的建立被引量：25
- 2009年
- 本研究采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)的方法。针对PPRV-N基因保守区域设计4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,可以实现DNA的梯状等温扩增。优化RT-LAMP的反应体系,并检验其灵敏性、特异性。一步法RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测结果出现仅需70 min,该方法具有良好的特异性,与同属的犬瘟热病毒无交叉反应,灵敏度是RT-PCR的1 000倍,是巢式RT-PCR的100倍。结果证明,RT-LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测PPRV,在基层和实验室都具有良好的应用前景。
- 李伟李刚范晓娟张坤贾风琴史利军Hermann Unger
- 关键词：小反刍兽疫病毒核酸检测
- 猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化
- 2009年
- 目的:本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)Cap蛋白。方法:PCV-2ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果:纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论:表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。
- 张锦秀晁生玉史利军候绍华李刚
- 关键词：核衣壳蛋白纯化
- 小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：5
- 2012年
- 目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。
- 田康乐李刚邱文英程朝飞
- 关键词：小反刍兽疫病毒F蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体
- 小反刍兽疫病毒H基因的原核表达与鉴定被引量：1
- 2009年
- 根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株的H基因序列,设计上下游引物并添加BamHⅠ酶切位点,以含有小反刍兽疫病毒H基因的Topo-PPRVH质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆于pEASY-T载体中,用BamHⅠ单酶切后将目的片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,核酸序列分析证明,成功构建了PPRVH原核表达质粒pET-32a-H。将pET-32a-H重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳,可见H蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为87ku,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量达到菌体总蛋白的38%,占包涵体蛋白的80%以上。Western blot鉴定表明,所表达的重组蛋白能被抗组氨酸单抗、抗PPRV标准阳性羊血清及抗PPRV疫苗的羊血清所识别,具有良好的免疫原性。
- 李伟李刚邱文英贾凤芹曾妮吴素丽
- 关键词：小反刍兽疫病毒H基因原核表达
- 检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立被引量：11
- 2009年
- 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清无交叉反应。
- 范晓娟李刚史利军张锦秀李伟
- 关键词：猪圆环病毒2型胶体金免疫层析抗体检测葡萄球菌蛋白A
