国家自然科学基金(81360042)
- 作品数：5 被引量：13H指数：3
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- 相关机构：宁夏医科大学中国人民解放军更多>>
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- NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达被引量：3
- 2014年
- 目的:构建核呼吸因子-1(NRF-1)基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1)后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)。方法:利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6.3-NRF1-IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1),然后用杀稻瘟素(blasticidin)筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果:收集的重组慢病毒滴度为5.5×107TU/ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2.25倍。结论:本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2(2-1)中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。
- 宋熔王程铖王强王玉姣李君良赵巍
- 关键词：慢病毒表达载体心力衰竭
- 缺氧培养下NRF-1基因对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响被引量：4
- 2016年
- 目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照,同时设计并合成干扰慢病毒载体;将重组质粒与包装质粒一同转染293T细胞,收集病毒颗粒后感染H9c2细胞并通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株;在1%O2、5%CO2、94%N2条件下培养转染的细胞株48h,使用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体膜电位。结果获得NRF-1过表达细胞株、空载体细胞株及shRNA干扰细胞株;缺氧条件下三组细胞存活率均减弱,与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达组细胞活力较高,shRNA干扰组的细胞活力最弱;另外,流式细胞术检测线粒体膜电位发现缺氧培养后线粒体膜电位下降。与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达细胞株线粒体膜电位下降较轻,shRNA干扰细胞株线粒体膜电位下降最明显。结论说明大鼠心肌细胞通过NRF-1基因的过表达可以减缓由缺氧造成的线粒体膜电位的下降,提高细胞在缺氧条件下的存活能力。
- 牛楠宋佳卉赵殷奇王浩朱明星佟雪琪李娜赵巍宋熔
- 关键词：大鼠心肌细胞缺氧细胞活力线粒体膜电位
- NRF-1基因敲除对NRK-52E细胞凋亡的影响
- 2019年
- 目的探讨NRF-1基因对NRK-52E细胞凋亡的影响。方法构建敲除NRF-1基因的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA,包装慢病毒,转染NRK-52E细胞,实验设control组、vector组和mutant组;通过嘌磷霉素筛选、T7E1酶切分析、Sanger测序及Western blot法筛选NRF-1基因稳定敲除的细胞系;用含H2O2的完全培养液(终浓度为500μmol·L-1)将control组、vector组和mutant组细胞培养4h建立NRK-52E细胞氧化应激损伤模型。Western blot法检测氧化应激条件下各组细胞中cyt-c、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果 T7E1酶切分析显示,sgRNA2为NRF-1基因的有效靶点;Sanger测序结果获得了3个基因缺失的突变体;Western blot结果显示,与control组及vector组比较,mutant组细胞中NRF-1蛋白表达水平降低(P<0.05或<0.01);NRF-1基因敲除后,与control组和vector组相比,氧化应激损伤时,mutant组细胞中的cyt-c、Cleaved-caspase3、Bax表达水平增高,Bcl-2表达水平降低(P<0.05或<0.01);Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡结果显示,与control组和vector组比较,氧化应激条件下mutant组细胞凋亡率增高[(11.45±0.64)%vs(3.45±0.14)%,(11.45±0.64)%vs(3.60±0.28)%)(P均<0.01)。结论 NRF-1基因敲除增强了氧化应激条件下NRK-52E细胞凋亡水平。
- 孙红丽牛楠董飞张婷瑞朱明星朱明星
- 关键词：急性肾损伤基因敲除细胞凋亡
- 大鼠NRF-1基因的克隆、鉴定及功能分析
- 2014年
- 目的克隆大鼠NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,了解NRF-1基本结构和蛋白分子特征,预测可能的相关作用蛋白分子,为下一步研究NRF-1对心衰细胞能量代谢途径的作用机制提供实验材料和依据。方法通过重叠延伸PCR(SOE PCR)的方法合成目的基因序列,连接于载体pMD18-T,然后转化至感受态大肠杆菌DH5α。PCR及测序鉴定重组质粒NRF-1/pMD18-T序列正确性。并通过生物信息学软件分析NRF-1的氨基酸序列,蛋白质二级结构,修饰位点及蛋白质之间作用关系等,进行预测。结果大肠杆菌DH5α中保存的重组质粒NRF-1/pMD18-T经测序鉴定,其中的NRF-1基因序列与原始序列一致。生物信息学分析表明NRF-1的蛋白质分子量为57.28kD,分子式为C2498H3976N704O808S15,等电点为5.28,是稳定的亲水蛋白,α-螺旋和β-折叠结构较多,NRF-1与mtTFA,Akt1和Spastin等多个蛋白关系密切。结论本研究成功地克隆了NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,为后续研究NRF-1对心衰心肌细胞能量代谢的调控机制提供了实验材料和研究思路。
- 王程铖宋熔李君良王玉姣王强赵巍
- 关键词：克隆
- 缺氧对大鼠心肌细胞损伤的影响及机制被引量：6
- 2017年
- 目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态;透射电镜观察细胞内部结构;活性氧检测试剂盒检测胞内活性氧(ROS);Western印迹法检测线粒体色素C蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞坏死程度。结果缺氧状态下,随着缺氧时间的不断增加,大鼠心肌细胞株H9C2的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变,细胞器结构明显损伤,ROS水平升高,线粒体细胞色素释放增加,细胞凋亡率明显增加,LDH的释放率明显增高。结论缺氧会造成大鼠心肌细胞的生长速度减慢、形态改变及心肌线粒体损伤,最终导致细胞凋亡和细胞坏死。
- 宋佳卉牛楠朱明星佟雪琪赵殷奇徐士梅宋熔赵巍
- 关键词：缺氧线粒体损伤凋亡坏死
