天津市自然科学基金(043606811)
- 作品数：5 被引量：44H指数：2
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- 人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析被引量：1
- 2005年
- 骨保护素 (OPG)成熟肽N端D1～D4结构域仅由 2个外显子编码 .以人基因组DNA作为模板 ,采用重叠延伸PCR得到N端D1～D4域编码序列 ,并在其上游引入 2×His密码子序列 ,然后克隆入载体pQE 30进行表达 ,SDS PAGE表明 8×His融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,可被抗OPG抗体识别 .变性条件下通过Ni NTA金属螯合亲和层析对表达产物进行纯化后再经梯度透析进行复性 ,采用破骨细胞样细胞 (osteoclast likecell ,OLC)诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性 ,证实单核 巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和破骨细胞分化因子 (ODF)可协同促进多核OLC的生成 ,但加入重组OPG片段后 ,OLC生成显著减少 .
- 王宝利戴芳梁晖张瑞吴亚锋郭刚张镜宇
- 关键词：骨保护素活性分析
- 小鼠破骨细胞样细胞的诱导培养及重组ODF胞外片段对其影响被引量：1
- 2004年
- 目的 :建立破骨细胞样细胞 (OLC)的体外培养方法并观察本室制备的重组小鼠破骨细胞分化因子(ODF)胞外片段对OLC生成的影响。方法:在无菌条件下取小鼠股骨 ,收集骨髓细胞 ,在重组小鼠ODF胞外片段和单核 -巨噬细胞集落刺激因子 (M -CSF)作用下诱导骨髓细胞向OLC分化。37℃5 %CO2 培养7d后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色 ,光镜下观察OLC生成情况 ,同时行扫描电镜鉴定。结果:ODF胞外片段诱导培养体系中有多核的OLC生成 ,且呈剂量依赖性 ,多组比较差别有统计学意义 (P<0.05)。结论:本实验建立的小鼠髓源OLC体外诱导培养方法 ,证实重组小鼠ODF胞外片段可显著促进OLC的生成。
- 戴芳王宝利梁晖戴晨琳邱明才
- 关键词：小鼠破骨细胞样细胞骨髓细胞M-CSF抗酒石酸酸性磷酸酶
- 改良TRIZOL法从矿化骨组织中提取总RNA被引量：15
- 2007年
- 目的:通过对TRIZOL法加以改进,建立一种快速、有效提取矿化骨组织中总RNA的方法。方法:改进TRIZOL法提取骨组织中的总RNA,在异丙醇沉淀RNA时加入高浓度的盐溶液。通过紫外分光光度法和1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA。进而以其逆转录所得的cDNA为模板经PCR扩增OPG基因予以鉴定。结果:改良TRIZOL法获得的总RNA完整,纯度好,产量高。结论:改良TRIZOL法是一种从矿化骨组织中提取总RNA的高效、便捷、可靠的方法。
- 郑纺王宝利张镜宇郭刚
- 关键词：RNA逆转录聚合酶链反应
- 重叠延伸PCR法在合成人骨保护素N端编码序列中的应用被引量：26
- 2004年
- 目的 :获得人骨保护素 (OPG)N端D1～D4结构域编码序列。方法 :OPGN端D1～D4域仅由2个外显子编码。采用改良方法自人血标本提取基因组DNA ,以此DNA作为模板 ,PCR分别扩增OPG基因外显子2和外显子3 ,并使外显子2的3'引物和外显子3的5'引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物的混合物作为模板 ,采用重叠延伸法再次进行PCR ,扩增产物克隆于载体pGEM -Teasy 进行序列分析。结果 :PCR扩增得到N端编码序列 ,序列分析证实该序列完全正确。结论 :重叠延伸PCR法合成人OPGN端编码序列的完成为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。
- 王宝利梁晖戴芳郭刚张镜宇
- 关键词：聚合酶链式反应骨保护素
- 基于重组PCR法构建人骨保护素N端的酵母表达载体被引量：1
- 2006年
- 目的:构建骨保护素(OPG)N端片段的酵母表达载体。方法:OPGN端D1-D4域仅由2个外显子编码。以人基因组DNA为模板,PCR分别扩增外显子2和外显子3,并使外显子2的3′引物和外显子3的5′引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物混合物为模板,采用重组PCR扩增OPGN端编码序列,拟插入酵母分泌型表达载体pPIC9K。为使未来分泌表达产物具有完全正确的N末端,再次采用重组PCR策略,将pPIC9K信号肽裂解位点前的一段序列(含单一限制酶位点BamHⅠ)与OPGN端编码序列拼接在一起,从BamHⅠ和EcoRⅠ位点插入pPIC9K。结果:得到了OPGN端酵母表达载体,测序证实插入序列正确。结论:重组载体的获得为基因工程研制具有生物活性的OPGN端片段奠定了基础。
- 李晓霞朱志峰王宝利戴芳郭刚张镜宇
- 关键词：破骨细胞成骨细胞聚合酶链反应
