浙江省教育厅科研计划(20020324)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：楼永良张家敏严杰应斌宇更多>>
- 相关机构：杭州医学院浙江大学温州医科大学更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金浙江省教育厅科研计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定
- 2006年
- 目的克隆创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)溶细胞素基因(vvhA),构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长vvhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列。采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性。结果所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%。在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体。结论该研究成功地构建了创伤弧菌vvhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原。
- 张家敏应斌宇楼永良严杰
- 关键词：克隆免疫性
- 创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的制备创伤弧菌（Vibrio vulnificus）溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性，为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达，Ni—NTA亲和层析法提纯rvvhA，SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株，有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0．5mmol／LIPTG诱导下，rvvhA产量可占细菌总蛋白的18％。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株，其中A5E8和C386株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体，其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C386单克隆抗体有较高特异性，与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应，对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1：4000～1：8000、免疫双扩散效价为1：4～1：8，Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株，rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。
- 张家敏楼永良应斌宇严杰
- 关键词：创伤弧菌原核表达单克隆抗体
