国家自然科学基金(30670830)
- 作品数：5 被引量：39H指数：3
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- 相关机构：上海交通大学医学院附属仁济医院上海交通大学医学院附属瑞金医院上海交通大学更多>>
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- α烯醇化酶靶向RNA干扰对原代培养乳鼠心肌细胞能量代谢及收缩功能的影响被引量：6
- 2008年
- 目的采用RNA干扰技术抑制培养大鼠心肌细胞α烯醇化酶的表达,探讨α烯醇化酶对心肌细胞能量产生和收缩功能的影响。方法针对α烯醇化酶基因,化学合成3对小片段干扰RNA(siRNA)(分别为针对α烯醇化酶mRNA 406～425位点的序列1,针对α烯醇化酶mRNA 656～675位点的序列2及针对α烯醇化酶mRNA 754～773位点的序列3)并转染原代培养的WKY大鼠心肌细胞。采用Real-time RT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测α烯醇化酶的表达情况,筛选其中沉默效应最好的序列(序列1)转染心肌细胞,即RNA干扰实验组,以未转染siRNA的心肌细胞为对照组,荧光素荧光素酶法检测细胞ATP水平,视频跟踪计算机测定系统测定细胞收缩反应,参数包括最大收缩幅度(dL),最大收缩速度(dL/dt_(max))。结果针对α烯醇化酶mRNA 406～425位点的siRNA显著下调α烯醇化酶mRNA和蛋白的表达,并且呈剂量和时间依赖关系,200 nmol/L可达到最大沉默效应,其下调α烯醇化酶mRNA和蛋白表达的最大效应分别出现在转染后24 h和48 h。α烯醇化酶沉默后细胞ATP产生减少(3.55×10^(-7)nmol/mg蛋白),dL[(0.82±0.02)μm]和dL/dt_(max)[(2.7±0.3)μm/s]下降。结论应用siRNA技术靶向α烯醇化酶mRNA 406～425位点可有效下调心肌细胞α烯醇化酶的表达,使细胞产能减少,收缩功能下降。
- 朱理安方宁远高平进金贤汪海娅
- 关键词：RNA干扰心肌细胞
- 自发性高血压大鼠肥厚左心室的蛋白质组学研究被引量：8
- 2008年
- 目的心肌肥厚是高血压患者心血管事件发生和死亡的主要危险因素,其机制仍未完全阐明。应用双向凝胶电泳/质谱的经典蛋白质组学方法,比较不同年龄自发性高血压大鼠(SHR)肥厚心肌的蛋白质表达谱的差异。方法取4周、20周龄雄性 SHR 和 WKY 大鼠,观察血压和心肌肥厚情况;抽提其左心室组织蛋白,经二维凝胶电泳(2-DE)分离蛋白,银染后计算机图象分析寻找蛋白表达差异点,并以基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF-TOF MS)分析鉴定蛋白。结果 SHR 在血压末升高时就已存在心肌肥厚。经二维胶图比较共找出27个差异蛋白点,质谱分析鉴定出20个差异蛋白,涉及能量代谢、线粒体氧化磷酸化和氧化应激反应等。其中13个蛋白的变化发生在4周龄 SHR 血压未升高时;另7个蛋白表达变化发生于20周龄血压持续升高状态下的 SHR 肥厚心肌中。结论 SHR 肥厚心肌中脂肪酸氧化和葡萄糖有氧氧化中的酶下调,而糖酵解的关键酶明显上调,且这些变化大多发生在血压升高前;线粒体氧化磷酸化的多种酶和一些参与抗氧化作用的蛋白均发生了变化,提示在 SHR 的心肌肥厚过程中物质能量代谢和氧化应激也具有重要作用。
- 金贤夏立王立顺石均芝方宁远
- 关键词：心肌肥厚高血压蛋白质组学自发性高血压大鼠
- α-烯醇化酶在内皮素-1诱导的肥大心肌细胞中的表达和调控通路
- 2008年
- 目的观察内皮素-1（ET-1）诱导的心肌细胞肥大模型中细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK1／2）、低氧诱导因子（HIF-1α），α-烯醇化酶（α-enolase）蛋白表达情况，探讨肥大心肌细胞α-enolase高表达的调控机制。方法建立ET1诱导的心肌细胞肥大模型，从细胞表面积、细胞蛋白合成速率和肌原纤维的重排3方面进行验证；将原代培养心肌细胞随机分为4组：（1）对照组；（2）PD98059干预组；（3）ET-1刺激组；（4）PD98059＋ET-1刺激组。免疫印迹方法检测ERK1／2、PERK1／2、HIF-1α、α-enolase的蛋白表达。结果ET-1刺激后心肌细胞表面积为（1350．7±107．5）μm^2，较对照组（896．1±70．2）μm^2增加（P〈0．05）；ET-1刺激后心肌细胞[^3H]亮氨酸掺入量较对照组增加[分别为（1387．9±14．8）dpm和（787．7±10．2）dpm，P〈0．01]；肌原纤维染色可见ET-1刺激后心肌细胞肌原纤维排列较对照组紧密、染色浓，表明ET-1能诱导心肌细胞肥大。ERK1／2抑制剂PD98059预处理的心肌细胞在ET-1刺激后细胞表面积和细胞的[^3H]亮氨酸掺入量均较ET-1刺激组减少[细胞表面积分别为（907．0±92．5）μm^2和（1350．7±107．5）μm^2，P〈0，05；[^3H]亮氨酸掺入量：（841．5±10．5）dpm和（1387，9±14．8）dpm，P〈0．053。ET-1刺激后心肌细胞有p-ERK1／2表达，其抑制剂PD98059在抑制ERK1／2活化的同时也部分抑制了HIF-1α、α-enolase蛋白的表达。结论ERK1／2的活化与ET1诱导的细胞肥大关系密切，在ET-1促心肌细胞肥大过程中，从MAPK／ERK1／2至HIF-1α及α-enolase这条信号通路可能参与α-enolase高表达的调控。
- 朱理安方宁远高平进金贤汪海娅
- 关键词：磷酸丙酮酸水合酶内皮缩血管肽类肌细胞
- α烯醇化酶——古老的蛋白,崭新的功能被引量：27
- 2007年
- α烯醇化酶又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶,它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸的转化,是糖酵解过程的限速酶。一直以来均认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白,然而最近的研究发现该酶的功能并不仅限于催化糖酵解反应,它还参与转录、凋亡的调控及细胞分化等过程,从而在一些生物学和病理生理过程中发挥重要作用。
- 朱理安方宁远
- 关键词：烯醇化酶糖酵解自身免疫
- 利用蛋白转导技术将α-烯醇化酶导入心肌细胞的实验研究
- 2008年
- 目的探讨将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞的可行性,为后续的蛋白功能研究奠定基础。方法原代培养WKY乳鼠心肌细胞,将纯化的α-烯醇化酶与蛋白转导载体Charoit共孵育后转染心肌细胞,同时设置阳性对照β-半乳糖苷酶转染组,光镜下计数转染阳性细胞的百分率;蛋白免疫印迹检测细胞总蛋白中α-烯醇化酶的表达;荧光共聚焦显微镜下观察α-烯醇化酶的亚细胞定位。结果Charoit能够将外源蛋白成功导入原代培养的心肌细胞中,光镜下可见β-半乳糖苷酶的导入效率约为81%,Western blot结果表明外源α-烯醇化酶成功导入了心肌细胞,免疫荧光显示导入的外源α-烯醇化酶与内源α-烯醇化酶相似,主要定位于胞浆。结论利用Charoit介导的蛋白转导技术能够成功将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞。
- 朱理安方宁远高平进金贤汪海娅
- 关键词：心肌细胞
