国家自然科学基金(39970376)
- 作品数：11 被引量：31H指数：4
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- LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析被引量：2
- 2001年
- KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.
- 韩骅王冀姝李荣牛利国孙强周鹏
- 关键词：基因剔除B淋巴细胞转录因子DNA结合蛋白
- 核糖体蛋白L6/Taxreb107的核定位信号的分析被引量：2
- 2002年
- 核糖体蛋白L6 (RpL6 ,Taxreb10 7)含有三个具有核定位信号特征的基序 .用作者构建的核定位信号捕获系统分析了这些核定位信号是否具有介导蛋白质进行核转位的功能 .将RpL6 /Taxreb10 7分段插入核定位信号捕获载体的克隆位点后转化宿主酵母 ,发现其前两个核定位信号可以介导融合蛋白进入细胞核 ,而第三个核定位信号无此作用 .将RpL6 /Taxreb10 7分段与绿色荧光蛋白融合后转染培养的哺乳类细胞 ,证实了以上在酵母中所得的结果 .进一步发现RpL6 /Taxreb10 7的前两个核定位信号同时具有核仁定位的功能 .当在细胞中表达的早期 ,进入核内的融合蛋白优先定位于核仁 .这些结果一方面有助于理解RpL6 /Taxreb10 7核转位的机理 ,同时说明作者构建的核定位信号捕获系统也可用在蛋白质中寻找核定位信号 .
- 王冀姝杨曦李荣周鹏张淼丽韩骅
- 关键词：核定位信号核转位绿色荧光蛋白
- 细胞内分布克隆——一种新的功能性基因克隆方法
- 2002年
- 明确蛋白质的细胞内定位对了解蛋白质的功能有很强的提示作用。近年来随着对蛋白质细胞内定位信号和转运机理的深入了解,建立了根据蛋白质分子在细胞内的特殊定位进行快速功能性基因克隆的方法,即细胞内分布克隆。其筛选基础可以是形态学的,也可以是功能上的。利用这些方法克隆了许多定位于特定细胞器但功能未知的蛋白基因。本文对这些方法及其进展进行综述。
- 王冀姝王莉韩骅
- 关键词：蛋白质细胞内定位
- suc2基因的克隆及在酵母基因组中的定位突变被引量：2
- 2000年
- 目的 克隆酿酒酵母的蔗糖转换酶基因 (suc2 ) ,并定位突变酵母基因组中的 suc2基因以获得无蔗糖转换酶表达的酵母品系 .方法 用 PCR法从酵母 Y190基因组中扩增出suc2的成熟肽基因片段 ,克隆后测序 .将色氨酸合成酶 (TRP)基因片段插入 suc2基因中 ,构建成用于同源重组的 suc2基因定位突变载体 .导入酵母 Y190 ,用营养缺陷筛选出 suc2基因突变的克隆 .用 PCR扩增并克隆突变后的 suc2基因 ,用序列分析确定同源重组的发生 .结果 用 PCR从酵母基因组DNA中扩增出大小约 1.5 kb的 suc2基因片段 ,序列测定表明除 5 85位有一点突变 (AAC变为 AAT)外 ,所得 suc2基因与文献报道相同 ;构建的定位突变载体导入酵母细胞后 ,得到4株营养型符合的突变体 ;PCR表明这些突变体中均有 suc2基因的同源重组 ;取其中 1株的 PCR产物进行序列测定证实了同源重组的发生 .结论 克隆了正确的编码蔗糖转换酶成熟肽的 suc2基因片段 ;用同源重组方法在酵母 Y190的基因组中定位突变了
- 孙强王冀姝陈萍柳天平牛利国韩骅苏成芝
- 关键词：同源重组克隆定位突变
- 核定位信号筛选系统的构建被引量：9
- 2000年
- 建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有
- 王冀姝陈萍孙强牛立国周鹏张浩韩骅苏成芝
- 关键词：核定位信号基因克隆酵母表达系统融合蛋白
- 信号肽捕获系统的建立被引量：9
- 2001年
- 细胞分泌性蛋白的分泌有赖于蛋白质Ｎ端的信号肽的存在。利用酵母建立了从ｃＤＮＡ文库中筛选编码信号肽的基因片段的遗传系统。为此，用一步基因破坏法对酿酒酵母ＥＧＹ４８基因组中的ｓｕｃ ２基因（编码酵母蔗糖转换酶）进行了定位突变，获得了无蔗糖转换酶表达的酵母株ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ。将无信号肽的ｓｕｃ ２成熟肽基因克隆于酵母乙醇脱氢酶（ＡＤＨ１）基因启动子下游，得到用于文库筛选的酵母真核表达载体。启动子与成熟肽基因之间为多克隆位点，用于插入待筛选的ｃＤＮＡ文库。用此载体转化酵母ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆可在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，但不能在以棉子糖为碳源的培养基上生长；在ｓｕｃ ２成熟肽基因前分别插入ｓｕｃ ２信号肽基因片段或人ＩＬ－２受体α 链信号肽基因片段，然后转染ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆既能在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，也能在以棉子糖为碳源的培养基上生长。表明构建的系统可用于筛选插入多克隆位点的ｃＤＮＡ片段是否具有编码信号肽的功能。
- 孙强王冀姝李荣周鹏黄红艳韩骅
- 关键词：同源重组信号肽基因克隆
- LIM结构域蛋白KyoT相互作用分子的筛选被引量：6
- 2002年
- KyoT为LIM结构域蛋白 ,可与转录因子RBP Jk相互作用。为了研究其功能 ,用酵母双杂交法筛选了与KyoT相互作用的蛋白。以KyoT2为诱饵筛选人淋巴结cDNA文库 ,从 5× 10 6 个克隆中共获得 4 2个阳性克隆。提取质粒进行酶切鉴定 ,获得 2 2个非重复克隆。对此 2 2个克隆进行序列分析 ,共获得 13种基因 ,其中包括已知的KyoT相互作用蛋白RBP Jk和两个未知基因。另一种被筛选到的已知基因是激活状态的信号转导物和转录因子 1活化物的抑制蛋白 (proteininhibitorofactivatedsignaltransducerandactivatoroftranscription 1,PIAS1)。由于KyoT在小鼠睾丸中表达较高 ,因此进一步探讨了KyoT2与PIAS1的相互作用。并首先在酵母中证实KyoT2与PIAS1的相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白 ,并以此为抗原制备了抗KyoT2多克隆抗体 ,再用GST pulldown实验验证了KyoT2和PIAS1在体外的相互作用。成功筛选了KyoT相互作用蛋白 ,发现并验证了KyoT与PIAS1的相互作用 。
- 李荣王冀姝孙强王键杨曦黄红燕周鹏韩骅
- 关键词：LIM蛋白酵母双杂交转录
- 几种细胞因子对小鼠核糖体蛋白L6表达的调控被引量：1
- 2002年
- 小鼠的核糖体蛋白RpL6启动子除了具有看家基因启动子的特点外 ,还含有多种转录因子的识别位点 .如GATA序列 1,γ干扰素核心序列 ,α干扰素应答序列 2等 ,提示RpL6的表达可为细胞外因子所诱导 .为了证实这一点 ,分别用促红细胞生成素、γ干扰素和α干扰素处理K5 6 2和Jurkat细胞 ,并用RNA印迹和荧光素酶报告试验检测了RpL6的mRNA水平和启动子活性 .RNA印迹结果显示 ,在上述细胞因子作用下 ,RpL6的mRNA水平均有所提高 .利用荧光素酶报告系统 ,用含有不同细胞因子识别位点启动子序列的报告质粒转染Jurkat和K5 6 2细胞 ,比较了启动子在细胞因子诱导前后的转录激活活性 .结果显示 ,细胞因子诱导后启动子活性明显升高 ,且与应答序列的存在与否有直接关系 .这些结果表明 ,细胞因子对RpL6转录的提高 ,是通过作用于启动子上相应的识别位点提高启动子活性而实现的 .
- 王冀姝韩骅
- 关键词：细胞因子小鼠
- LIM蛋白KyoT2与人类紧密连接蛋白2的相互作用被引量：1
- 2002年
- KyoT是一种LIM结构域蛋白 ,是以RBP J为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统得到的新分子。KyoT2可以抑制RBP J介导的转录。以KyoT2为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交筛选得到了人类紧密连接蛋白 2 (ZO 2 )的一种新的剪接体ZO 2 i3。序列分析表明 ,新的剪接体有 19个外显子 ,与已发表序列比较 ,见ZO 2 i3分子的激酶后区发生了改变。为排除酵母双杂交实验的假阳性 ,实验首先在酵母中验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中原核表达纯化带有His标签的KyoT2蛋白 ,使用抗His标签的抗体 ,通过GSTpull downassay验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用 ,也获得阳性结果。并通过酵母实验初步确定了其作用位点 ,即KyoT2通过LIM2结构域与ZO 2 i3相互作用。本实验验证了KyoT2与ZO 2 i3的相互作用 ,并初步确定其相互作用位点 ,对探讨KyoT的功能具有重要意义。
- 黄红艳李荣孙强王健周鹏韩骅张万会
- 关键词：LIM蛋白相互作用
