国家自然科学基金(39630020)
- 作品数：16 被引量：35H指数：4
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- 丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认被引量：3
- 2003年
- 目的 用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法 在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结果 成功地表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,用此蛋白检验了 130份HCV阳性血清 ,阳性率为 36 %。在筛选的噬菌体展示随机肽库后 ,挑取 13个阳性克隆测序 ,有 9个序列不同 ,最终通过噬菌体表位表达的方法确认了 3个表位。
- 侯利华杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定被引量：4
- 2002年
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;
- 杜桂鑫侯利华陈万荣张永国王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽噬菌体展示肽库
- 丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究被引量：1
- 2001年
- 目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性，在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后，通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果在 Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白，二者在 ３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在，ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在，通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。
- 侯利华杜桂鑫来大志王海涛
- 关键词：肝炎病毒丙型RNA聚合酶ELISA
- 丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探被引量：1
- 2001年
- 探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录 巢式PCR从 1份HCV慢性携带者的阳性血清及 1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA ,将其克隆于T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示克隆到HCVNS2全长基因 ,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架 (ORF)为主 ,一个于HCV多聚蛋白第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主 ,其中三个于第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个于第 887位氨基酸的位置出现终止信号 ,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较 ,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端 ,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似。研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看 ,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异 ,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性。
- 冷彦陈秀珠杜勇毛春生杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒准种
- 丙型肝炎病毒NS3区C末端HLA-11限制性CTL表位的作用
- 2000年
- 目的 研究丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus,HCV)非结构 3区 (NS3) C末端 HL A- 11限制的细胞毒 T细胞(CTL )表位在 HCV感染中的作用 .方法 血清学方法检测 3例患者的 HL A分型 ,他们均存在 HL A- A11表型 ,以 HL A- 11结合基序为依据 ,预测了 HL A- 11限制的 CTL 表位 . 2例慢性患者 5 a内 3个时间点和 3a内 2个时间点及转阴患者的血清样本 ,用反转录 PCR扩增出 HCV基因片段 ,Sanger法测定核苷酸序列 ,并翻译成蛋白质 .结果 慢性 HCV感染者 2例预测的 HL A- A11限制的 CTL 表位都未发生明显改变 ,而在1例 HCV转阴者存在 1个改变的 HL A- 11限制性 CTL表位(序列为 IIL THPVTK) ,然而经 T细胞增殖实验表明此表位不是 T细胞表位 .结论 在 HCV NS3蛋白 C末端可能不存在与 HCV转归有关的 HL A- A11限制的 CTL
- 汪涛郭华章徐俊杰齐连权王国力金伯泉王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒表位细胞毒T细胞
- 丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究被引量：4
- 2000年
- 对 2例HCV持续性感染者 2个时间点NS3区C末端克隆测序 ,研究HCVNS3蛋白一个辅助T细胞表位 (氨基酸位 12 4 8 12 61)在HCV感染者体内的保守性 ;人工合成该表位进行淋巴细胞增殖试验和抑制试验 ,观察该表位引起免疫应答的水平和特点 ;通过“刺激 休息 刺激”多轮循环建立该表位特异性的T细胞系 ,并用流式细胞仪鉴定表型。结果发现该表位在 2个病人 2个时间点均未变化 ;观察的 2例HCV持续性感染者和 1例感染恢复者均对该表位有较强CD4 +T细胞应答。建立了针对该表位的表型均一的CD4 +辅助T细胞系。本研究提示该表位是一个序列保守的强辅助T细胞表位 ,对HCVT细胞疫苗的研制有一定意义。
- 徐俊杰汪涛齐连权王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒辅助T细胞表位T细胞系
- 表位水平研究病毒流行病学的方法探讨被引量：2
- 2002年
- 应用噬菌体随机展示肽库和硫氧还蛋白表面展示技术 ,建立了在表位水平研究病毒流行病学的方法 ,并以丙型肝炎病毒核心区蛋白做了初步验证 。
- 来大志杜勇杜桂鑫陈薇王海涛
- 关键词：表位流行病学肽库噬菌体硫氧还蛋白HCV
- 一种新的丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶基因的构建、表达与鉴定
- 2002年
- 根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .
- 杜桂鑫侯利华陈万荣刘树玲张永国孙大铭王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒基因表达
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶抗原性分析及特异性抗体制备被引量：1
- 2002年
- 目的 分析丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶的抗原性并制备特异性抗体。方法 构建表达质粒并且在大肠杆菌中可溶性表达单链型丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶 ;以纯化后的重组蛋白包被酶联板对 86份献血员和 12份健康人血清中的特异性抗体进行检测 ;将纯化蛋白偶联到Sepha rose 4B上制备亲和纯化柱 ,对丙肝病毒感染者血清中的特异性抗体进行亲和纯化 ;以纯化蛋白免疫小鼠 ,制备特异性单克隆抗体 ,对纯化后的人多抗和鼠单抗进行鉴定。结果 以纯化的重组单链丝氨酸蛋白酶为抗原检测 98份血清 ,结果阳性率为 73.9%,商品试剂盒漏检的 1份血清中也检测出特异性抗体。用重组蛋白从 2 0 0mlHCV感染者血清中亲和纯化到 4.5 7mg多克隆抗体 ,效价达 10 7,特异性很好。制备的 4株IgG类鼠单抗 ,无交叉反应 ,能够被人血清抗体竞争性抑制。结论 表达的HCV丝氨酸蛋白酶具有良好的抗原性 ,在HCV感染人群中该区域抗体的阳性率较高 ,制备了特异性很好的多克隆抗体和单克隆抗体。
- 杜桂鑫刘树玲侯利华陈万荣王海涛
- 关键词：抗体制备丙型肝炎病毒抗原性丝氨酸蛋白酶HCV丙型肝炎
- 两株乙型肝炎病毒基因组结构分析及其复制和抗原表达特性的比较被引量：4
- 2000年
- 为从全基因组水平研究乙型肝炎病毒 (HBV)的核苷酸结构及复制和抗原表达特性 ,分别从 2例HBsAg和HBeAg阳性、HBVDNA滴度为 10 14 和 10 13 拷贝 /ml的慢性乙型肝炎患者 (编号为 5 6和 2 18)血清中扩增、克隆了HBV全基因组 ,并测定了核苷酸序列。两株病毒基因组转染HepG2细胞的培养上清中HBsAg表达水平基本相同 ,但 # 5 6毒株表达的HBeAg约为 # 2 18株的 3倍 ,Southern印迹及核酸杂交显示 ,# 5 6HBV株复制效率显著高于 # 2 18株 ,两株HBVDNA全长均为 32 15个核苷酸 ,同源性为 98 7% ,均为B基因型 (adw亚型 )。两者相差的42个核苷酸分布在C、Pre S1、Pre S2、P及X基因编码区 ,其中有位于SPⅠ、SPⅡ、Xp和ENHⅠ基因调控序列区中。 # 5 6患者感染的毒株基因组中Pre S2起始密码ATG变异为GTG ,但由Pre S1起始翻译形成的大蛋白中包括Pre S2的部分氨基酸 ,故 # 5 6血清和 # 5 6株转染细胞的培养上清仍可与Pre S2抗体出现阳性反应。
- 武力袁正宏何丽芳蒋伟伦邱申熊闻玉梅
- 关键词：乙型肝炎病毒基因组抗原表达
