北京市自然科学基金(7131001)
- 作品数：11 被引量：16H指数：2
- 相关作者：杨慧鲁玲玲段春礼高歌杨巍巍更多>>
- 相关机构：首都医科大学北京王府中西医结合医院北京脑重大疾病研究院更多>>
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- PINK1减轻α-突触核蛋白引起的线粒体损伤被引量：1
- 2016年
- 目的证明PINK1对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)引起的线粒体损伤的影响。方法将携带人源PINK1和α-syn基因的质粒共转染MN9D多巴胺能神经细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体渗透性转运孔(mitochondrial permeability pore,mPTP)的开放情况及线粒体膜电势(ΔΨm)变化;MTT和乳酸脱氢酶法检测细胞活力及细胞损伤情况。结果 PINK1减少α-syn引起的ROS的生成、线粒体膜孔的开放及线粒体膜电势降低,并减轻α-syn所致细胞活力下降及和细胞损伤。结论 PINK1可以减轻α-syn引起的线粒体损伤。
- 王雪申甲梅高歌段春礼鲁玲玲杨慧
- 关键词：PINK1Α-突触核蛋白线粒体
- 帕金森病相关基因α-突触核蛋白和PINK1对Nurr1的调节作用被引量：3
- 2015年
- 目的探讨帕金森病相关基因α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)对转录因子Nurr1的调节作用。方法利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的方法检测α-syn与Nurr1的相互作用。同时,在PINK1基因敲减的细胞模型中,通过双荧光素酶报告系统检测PINK1对Nurr1转录激活活性的调节作用。结果 FRET检测显示,CFP-α-syn与YFP-Nurr1之间发生了荧光共振能量转移的现象。其FRET效率大约为20.52%。提示α-syn与Nurr1之间可能存在直接的相互作用。对于PINK1基因敲减的细胞进行研究发现,在PINK1被抑制表达24 h或48 h后,Nurr1的活性显著下调。结论以往研究提示α-syn可能是Nurr1的抑制因子。研究显示α-syn可能与Nurr1直接结合而抑制其活性。而PINK1对Nurr1可能存在一个正性调节作用。因此,二者对Nurr1的调节可能存在一个相互协调、相互制约的关系。
- 鲁玲玲施予晴魏雨菲贾焕珍乔芳伟杨慧
- 关键词：帕金森病Α-突触核蛋白转录调控
- α-突触核蛋白通过氨基端引起MN9D细胞线粒体膜损伤被引量：1
- 2015年
- 目的在MN9D细胞中,探讨α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)氨基端(α-syn/N),NAC区,及C端(α-syn/C)对细胞及线粒体的作用。方法将细胞分为未处理组(control),空载体组(Myc),α-syn过表达组(α-syn),α-syn/N过表达组(α-syn/N),α-syn/del N过表达组(α-syn/del N),α-syn/NAC过表达组(α-syn/NAC),α-syn/C过表达组(α-syn/C),α-syn/del C过表达组(α-syn/del C)并瞬时转染α-syn各结构域48 h。用MTT和LDH法检测过表达α-syn各个结构域对细胞活力及LDH释放情况的影响,通过共聚焦显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS水平,线粒体渗透性转运孔(m PTP)的开放情况及线粒体膜电势(ΔΨm)变化,用免疫荧光染色检测线粒体形态。结果过表达α-syn,α-syn/N,α-syn/del C能使细胞活力下降(P<0.01),LDH的释放量明显增加(P<0.01),细胞内活性氧(ROS)水平增加(P<0.001),线粒体渗透性转运孔(m PTP)异常开放增加(P<0.01),线粒体膜电势下降(P<0.01)。并且过表达α-syn/N后,55%的线粒体出现气球样改变。结论α-syn通过其氨基端引起线粒体膜损伤。
- 高歌申甲梅段春礼王雪鲁玲玲张建亮杨慧
- 关键词：Α-突触核蛋白ROS
- TRPC3参与α-突触核蛋白引起的线粒体损伤被引量：2
- 2017年
- 目的探讨经典型瞬时受体电位通道3(transient receptor potential canonical channel 3,TRPC3)是否参与α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)引起的线粒体损伤。方法在α-syn过表达原代培养神经元、α-syn转基因及敲除小鼠模型,利用免疫印迹和免疫荧光技术检测TRPC3和α-syn在线粒体内的定位和表达;在原代培养神经元,运用MTT和乳酸脱氢酶法检测细胞活力和受损情况,JC-1法检测线粒体膜电势,观察敲减TRPC3对α-syn过表达引起的线粒体损伤和细胞损伤的影响。结果 TRPC3和α-syn共同表达于线粒体,过表达α-syn增加TRPC3在线粒体的分布,敲除α-syn则下调TRPC3在线粒体的分布。敲减TRPC3明显减轻过表达α-syn引起的线粒体膜电势下降和细胞毒性。结论 TRPC3可能参与过表达α-syn引起的线粒体损伤。
- 卢勇泉陈敏高歌段春礼鲁玲玲杨慧
- 关键词：帕金森病神经元Α-突触核蛋白线粒体
- 蛋白磷酸酶2A活力增高减轻α-突触核蛋白引起的SK-N-SH细胞凋亡被引量：2
- 2013年
- 目的观察蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活力在α-突触核蛋白(α-Syn)引起的细胞凋亡中的作用。方法在SK-N-SH细胞中瞬时转染空载(myc)和α-Syn质粒,免疫荧光化学方法鉴定基因表达情况。Western blotting法和PP2A酶活力检测试剂盒检测PP2A磷酸化水平及酶活力。TUNEL染色和MTT法检测各组细胞死亡情况。结果过表达α-Syn可致磷酸化PP2A(pPP2Ac)水平显著增高及活力降低,同时导致细胞凋亡增多和细胞活力降低。PP2A激动剂C2-ceramide可显著逆转α-Syn所致细胞凋亡。结论 PP2A活力增高可减轻α-Syn过表达引起的细胞凋亡。
- 杨巍巍杨慧于顺
- 关键词：Α-突触核蛋白蛋白磷酸酶2A帕金森病凋亡
- 原子力显微镜检测α-突触核蛋白转基因鼠线粒体微观结构的变化被引量：1
- 2016年
- 目的使用原子力显微镜检测α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)转基因小鼠模型中,皮质线粒体表面微观结构的变化。方法提取野生型和转基因小鼠皮质细胞线粒体,使用共聚焦显微镜检测其膜电势变化,使用原子力显微镜的敲击模式检测线粒体膜表面的微观结构。结果 JC-1染色法检测线粒体膜电势结果显示,转基因小鼠线粒体膜电势与野生组相比降低20.4%,差异有统计学意义(P<0.01);原子力显微镜观察结果显示,转基因小鼠线粒体长度与野生组相比增加,表面光滑度减低,线粒体膜孔增多(P<0.05)。结论α-Syn的转基因小鼠线粒体膜电势减低,线粒体膜完整性受到破坏。在原子力显微镜敲击模式下检测离体线粒体,能反映出转基因小鼠线粒体膜表面微观结构的变化。
- 高歌汪志鹏段春礼鲁玲玲杨慧
- 关键词：原子力显微镜线粒体Α-突触核蛋白
- DJ-1可通过增强自噬水平缓解鱼藤酮致MN9D细胞损伤
- 2013年
- 目的探讨DJ-1对MN9D细胞的保护作用及具体机制。方法在MN9D细胞中瞬时转染DJ-1质粒,利用MTT法及流式细胞术分别检测MN9D细胞活力与凋亡水平。通过激光共聚焦显微镜(confocal)观察LC3自噬点数量。利用Western blot法检测LC3II/LC3I的比值。结果过表达DJ-1能部分恢复鱼藤酮引起的细胞活力下降(P<0.05)且可以减少鱼藤酮引起的MN9D细胞凋亡(P<0.05)。过表达DJ-1增加了鱼藤酮处理的MN9D细胞内荧光点的数量(P<0.001)且使LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著增高(P<0.001),应用3-MA干预后,细胞内荧光点数量回落到基础水平,且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显降低(P<0.05)。同时应用自噬抑制剂3-MA干预后,DJ-1的细胞保护作用消失。结论 DJ-1通过激活自噬,起保护作用能减轻鱼藤酮引起的毒性。
- 刘慧丰杨巍巍高华杨慧
- 关键词：自噬鱼藤酮
- 慢病毒载体介导下DJ-1过表达细胞模型的建立被引量：3
- 2018年
- 目的构建人野生型DJ-1及其L166P突变体的慢病毒载体并探讨慢病毒载体在构建基因过表达细胞模型中的作用。方法分别构建野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1慢病毒载体质粒。进行测序确定比对正确后,进行质粒的大量扩增与制备并转染包装细胞系HEK293T细胞,荧光法和Western blot检测野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1在细胞系中的表达。在确定目的蛋白正确表达之后,大量转染HEK293T细胞进行包装并生产携带目的基因的慢病毒颗粒。测定病毒上清滴度后感染PC12细胞,荧光显微镜和Western blot观察GFP荧光强度以及目的蛋白的表达,确定病毒的感染效率。结果成功构建携带DJ-1野生型及其突变体的慢病毒载体。该病毒载体可以转染进入HEK293T细胞内且目的蛋白能够正确表达。LV-DJ-1与LV-DJ-1/L166P的病毒滴度分别为2×10~9TU/m L与2×10~8TU/m L。病毒上清可以高效感染PC12细胞,绝大多数细胞可表达目的蛋白。外源野生型DJ-1和L166P突变体的蛋白表达量分别是内源性含量的315%和285%。结论慢病毒感染细胞效率很高,是很好的制备基因过表达细胞的方法。通过慢病毒载体介导,本研究获得了DJ-1及其突变体的过表达细胞模型。该模型可以用于后续DJ-1功能研究。
- 任静李毅杨慧鲁玲玲
- 关键词：帕金森病DJ-1PC12细胞慢病毒载体
- PINK1对酪氨酸羟化酶的表达调控被引量：1
- 2015年
- 目的探讨帕金森病相关基因PINK1对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达调控作用。方法分别建立PINK1基因敲减组(转染携带有PINK1小干扰RNA片段的质粒)和PINK1基因过表达(转染PINK1真核表达质粒载体)的MN9D细胞模型,通过实时定量PCR法(real-time RT-PCR)和Western blot法分别检测THmRNA水平和蛋白水平,以评测改变细胞内PINK1含量对于TH表达的影响。结果在转染后48 h检测时发现,PINK1基因敲减组较对照组TH mRNA水平下调可达76.3%(P<0.001);与对照组相比,蛋白水平亦明显降低,降低幅度达74.1%(P<0.001)。与此同时,检测到p-TH的蛋白水平也降低约75.1%(P<0.001),但是p-TH/TH的水平没有明显改变。在MN9D细胞中瞬时转染PINK1野生型及突变体G309D,发现过表达野生型PINK1组TH蛋白水平明显增加(增加115.9%,P<0.05),但是过表达PINK1突变体G309D组无明显差异(P>0.05)。结论 PINK1可调节多巴胺合成过程中的限速酶TH的转录及蛋白的表达,而其G309D突变体表现为此项功能的缺失。
- 鲁玲玲贾焕珍杨慧
- 关键词：帕金森病PINK1RNA干扰酪氨酸羟化酶
- α-突触核蛋白对线粒体膜造成孔道样损伤被引量：2
- 2018年
- α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)作为第一个发现的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)致病基因,在PD发生发展过程中具有重要作用。尽管有研究发现,α-syn对线粒体功能有损伤作用,但其对线粒体膜的损害机制尚不明确。本实验旨在探究α-syn对线粒体膜形态的影响,并找到更加微观的方式观察线粒体膜的变化。Thy-1-α-syn转基因动物与野生型动物相比,线粒体膜电势降低17%(P<0.01),膜通透性增加20.5%(P<0.01),转基因组线粒体细胞色素C释放增多64%(P<0.01),这有可能引起线粒体自噬和细胞凋亡。原子力显微镜结果显示,野生型小鼠脑组织线粒体表面光滑,α-syn转基因小鼠脑组织线粒体表面发现有锯齿状改变,而且在过表达α-syn的原代神经元线粒体膜表面有许多小凹陷,出现口径60~200 nm,深达20~60 nm的孔道。这可能是α-syn对线粒体膜造成的孔道样损伤。过表达α-syn全长组和N端组的原代神经元电镜结果显示,线粒体膜被破坏,并且出现空泡样线粒体和自噬小泡。本研究发现,过表达α-syn可能在线粒体表面形成孔道样改变,α-syn的N端是引起线粒体膜损伤主要结构域。
- 汪志鹏高歌高歌杨慧
- 关键词：帕金森病Α-突触核蛋白N端结构域原子力显微镜
