国家自然科学基金(30670904)
- 作品数：10 被引量：11H指数：2
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- 抗血管性血友病因子抗体在特发性血栓性血小板减少性紫癜发病机制中的作用被引量：4
- 2012年
- 目的在具有正常血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）活性且不存在抗ADAMTS13自身抗体的特发性血栓性血小板减少性紫癜（1vrP）患者血浆中检测是否存在抗血管性血友病因子（VwF）自身抗体，并通过体外实验验证鼠源性抗人VwF单克隆抗体（单抗）是否可以降低ADAMTS13对VwF的裂解活性。方法本研究为临床实验诊断研究。应用酶联免疫吸附试验对53例成人特发性1TrP患者检测抗VWF自身抗体，采用十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳进行VwF多聚体分析，检测是否存在超大分子量VwF（uL—VWF）多聚体。并且，在高剪切力和变性条件下分别观察8种鼠源性抗VwF单抗对重组ADAMTS13（rADAMTS13）裂解血浆源纯化VwF的活性的影响。结果在2例具有正常血浆ADAMTS13活性且不存在抗ADAMTS13自身抗体的特发性TrP患者血浆中检测到抗VwF自身抗体和UL—VwF多聚体。另外，一种鼠源性抗人VwF单抗SZ34在高剪切力条件下能够降低rADAMTS13对VwF的水解活性，但在静态／盐酸胍变性条件下并无此影响。结论抗VwF抗体有可能是具有正常ADAMTS13活性且不存在抗ADAMTS13自身抗体的特发性TTP患者的发病原因之一。
- 张敬宇刘芳马珍妮董宁征苏健赵益明沈飞汪安友阮长耿
- 关键词：VONWILLEBRAND因子自身抗体
- 慢性肾脏病患者血浆血管性血友病因子裂解酶活性测定
- 2009年
- 目的检测慢性肾脏病（CKD）患者血浆血管性血友病因子裂解酶（vWF-CP）活性及血浆血管性血友病因子（vWF）水平，探讨其在慢性肾脏病的意义。方法将139例CKD患者根据不同种类肾病及不同肾功能状态分组，其中狼疮肾炎（LN）31例，原发性肾病综合征（NS）25例，糖尿病肾病（DN）45例及慢性肾炎（CGN）38例；CKDⅠ期38例，CKDⅡ期30例，CKDⅢ期39例，CKDⅣ期19例，CKDⅤ期13例。采用残余胶原结合实验法及ELISA法对患者血浆vWF-CP活性及vWF水平进行检测，观察不同组患者血浆vWF-CP活性及vWF水平，并与正常对照组（40名）比较。结果LN、NS、DN及CGN患者血浆vWF-CP活性显著低于对照组，且以LN、NS组下降最明显，vWF水平均显著高于正常对照组，血浆vWF含量均与血浆vWF-CP活性呈负相关。CKDⅡ期、Ⅲ期血浆vWF-CP活性显著低于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ期．而Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ期之间无显著区别，vWF含量各期之间无显著差别。结论CKD患者血浆vWF-CP活性明显降低，其低下程度与肾病的病种有关。内皮损伤、自身抗体可能是致CKD患者vWF-CP活性低下的原因之一。它参与了CKD的发生发展，可能是CKD血栓形成的机理之一。
- 刘金霞胡坤卢国元王兆钺苏健阮长耿
- 关键词：慢性肾脏病血管性血友病因子血管性血友病因子裂解酶
- 阻断血管性血友病因子与胶原结合的抗人vWF—A3单抗的鉴定和功能研究
- 2008年
- 目的制备阻断血管性血友病因子（von Willebrand因子）A3区（vWF-A3）与胶原结合的抗vWF-A3单抗，并对其进行生化鉴定和功能研究。方法用重组vWF-A3蛋白免疫BALB／c小鼠，经标准的方法制备单抗。用ELISA法鉴定单抗特异性，经vWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗，用免疫印迹技术确定单抗与重组（r）vWF-A3和还原性人vWF识别的抗原分子。经胶原结合试验确定单抗对vWF与胶原结合的影响。结果获得一组共30株抗vWF-A3单抗，其中两株确定为抑制vWF与胶原结合的单抗，分别命名为SZ-123和SZ-125，两株单抗分别与rvWF-A3和vWF强反应，而不与rvWF-A1、A2反应。免疫印迹分析显示SZ-123和SZ-125分别识别相对分子质量为27×10^3的rvWF-A3、250×10^3还原性人vWF单体和170×10^3的vWF酶切片段。单抗SZ-123和SZ-125不仅剂量依赖性地抑制纯化的人血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合，而且分别抑制人、猕猴或Beagle犬血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合。结论抗vWF-A3单抗SZ-123和SZ-125是两株抑制性单抗，有望成为具有治疗潜力的抗血栓药物。
- 赵益明董宁征沈飞谢丽倩阮长耿
- 关键词：WILLEBRAND因子胶原
- 血管性血友病因子裂解蛋白酶的稳定表达及其活性检测被引量：7
- 2010年
- 本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13),进一步研究其在血栓止血中的作用。利用脂质体将编码ADAMTS13全长序列的重组质粒pSecTag-ADAMTS13转染Hela细胞,用潮霉素(Hygromycin-B)筛选得到阳性克隆细胞株,并扩大培养,收集上清。利用Ni-NTA琼脂糖柱、梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Westernblotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,采用GST-His双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果显示,成功获得一株能恒定分泌重组ADAMTS13蛋白的细胞株ADAMTS2-4,每1L培养上清可纯化得到5.8mg重组蛋白。Western blotting结果显示,ADAMTS13多抗能与重组蛋白在190kDa处显单一条带,并且蛋白具有6.4U/mL的剪切活性(每毫升正常人混合血浆中ADAMTS13活性为1U)。重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性,为进一步研究ADAMTS13作用机理和运用奠定了良好的基础。
- 马珍妮董宁征张敬宇苏健汪安友阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子裂解蛋白酶真核表达重组蛋白
- vWF/ADAMTS13在慢性肾脏病中的临床意义
- 2011年
- 目的探讨血管性血友病因子(vWF)及其裂解蛋白酶(ADAMTS13)在慢性肾脏病中的临床意义。方法选取慢性肾脏病患者47例为实验组(A组),其中原发性肾小球疾病(A1组)24例,狼疮性肾炎(A2组)23例;另设体检健康成人30例为正常对照组(B组)。A1组患者均行肾活检,其中非膜性肾病15例(C1组),膜性肾病9例(C2组)。ELISA法、FRETS-vWF73法分别检测血浆中vWF含量、ADAMTS13活性,免疫组化法检测vWF和ADAMTS13在肾脏的表达。结果与B组相比,A1、A2组血浆中ADAMTS13活性降低,而vWF浓度升高(P<0.01);A组患者血浆vWF/ADAMTS13与24-h尿蛋白定量呈正相关(r=0.477,P<0.01);C2组ADAMTS13的表达明显低于C1组(P<0.05)。结论血浆中vWF与ADAMTS13的平衡失调可能与慢性肾脏病的临床和病理类型有关。
- 沈蕾卢国元蒋丽琼马珍妮汪安友董宁征阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子血管性血友病因子裂解蛋白酶慢性肾脏病
- ADAMTS13蛋白C-末端结构调节其酶活性的研究
- 2010年
- 目的 初步研究并探讨ADAMTS13蛋白C-末端结构域变化在调节其酶活性方面的作用.方法 将人全长野生型及缺失C-末端TSP8和CUB结构域的截短型重组ADAMTS13基因转染Hela细胞并稳定表达.分别在静态尿素变性条件及蜗旋装置提供的高剪切力条件下观察这两种ADAMTS13蛋白酶切血管性血友病因子（vWF）的差异,同时利用Western blot技术及残余胶原结合实验对结果进行检测,另外利用ELISA法直接检测这两种ADAMTS13蛋白静态条件下结合vWF的能力.结果 在Hela细胞真核表达载体表达并纯化了全长野生型及缺失C-末端TSP8和CUB结构域的截短型ADAMTS13蛋白,分别利用鼠抗His-Tag单抗（抗载短型ADAMS113单）及兔抗人ADAMTS13多抗Western blot法鉴定了其特异性.静态尿素变性条件下,截短型ADAMTS13蛋白酶活性显著高于野生型,且静态条件下在结合vWF的能力方面,截短型也显著高于野生型;但在高剪切力作用下,只有全长野生型ADAMTS13可以对vWF进行剪切.结论 ADAMTS13蛋白C-末端TSP8和CUB结构域在不同条件下可以调节ADAMTS13蛋白结合vWF的能力,从而调节其酶活性的发挥,ADAMTS13蛋白C-末端在高剪切力作用条件下对ADAMTS13酶活性的发挥至关重要.
- 汪安友刘芳马珍妮董宁征张敬宇阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子酶活性
- 血管性血友病因子vWF73和vWF114片段的表达及其在ADAMTS13活性测定中的应用
- 2011年
- 目的构建血管性血友病因子（vWF）A2区片段vWF73和vWF114的表达质粒，在大肠杆菌中表达两种谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白，并探讨两种蛋白作为底物在测定ADAMTS13活性中的应用价值。方法应用PCR的方法扩增vWFA2区内vWF73和vWF114的相应DNA片段，分别克隆至GST融合表达载体pGEX-6P-1进行诱导表达，Ni—NTA琼脂糖柱纯化可溶性蛋白部分。以Western blot法检测正常人血浆、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）患者血浆和重组ADAMTS13（rADAMTS13）水解两种重组vWFA2区片段的情况，并以此为底物用抗GST和抗His两种抗体建立酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血浆ADAMTS13活性的新方法。结果成功表达和纯化了ADAMTS13的两种可溶性小分子底物GST—vWF73-H和GST—vWF114-H，均能被rADAMTS13或正常人血浆有效地水解，而遗传性和特发性ttP患者血浆则无此作用。同时，以此为底物建立了测定ADAMTS13活性的ELISA方法。结论采用原核表达系统成功得到了vWFA2区片段vWF73和vWF114两种GST融合蛋白，可作为底物用于ADAMTS13活性的测定。
- 张敬宇马珍妮董宁征胡璐萍苏健王兆钺阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子融合蛋白血管性血友病因子裂解酶
- 人血小板膜糖蛋白GPIbα(H1-V289)的原核表达及其生物活性研究
- 2010年
- 目的获得重组的血小板膜糖蛋白GPIbα的N端片段(1-289氨基酸),进一步研究其在血栓与止血过程中的生物功能。方法利用质粒pCMV3(编码GPIbαH1-V289)设计引物,构建pQE30-GPIbα(H1-V289)表达载体,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA琼脂糖层析柱不同pH值梯度淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,并观察重组蛋白对瑞斯托霉素和ADP诱导血小板聚集的影响。结果成功获得纯度较高的重组GPIbα(H1-V289)蛋白,浓度为0.6 mg/ml。Western blot检测结果显示,抗GPIbα单抗SZ2能在34 kd区域显示条带。而且纯品能有效抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,对ADP诱导的反应无抑制作用。结论重组蛋白具有较好的免疫原性和生物活性,并可以大量获得,为开发抗血栓药物奠定了基础。
- 马珍妮董宁征白霞杨剑峰谢丽倩阮长耿
- 关键词：瑞斯托霉素
- A1500E突变对血管性血友病因子的ADAMTS13依赖性水解的影响
- 2012年
- 目的研究血管性血友病因子（VWF）A1500E突变体对金属蛋白酶ADAMTS13敏感性的改变，为VWF—A1500E突变导致2A型血管性血友病（VWD）的发病机制提供直接依据。方法将野生型VWF质粒和A1500E突变体VWF质粒分别瞬时转染HeLa细胞，收集并浓缩培养上清，分别用重组人ADAMTS13（rADAMTS13）进行水解，然后通过十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳进行VWF多聚体分析，观察与野生型VWF相比，A1500E突变体VWF对ADAMTS13的敏感性有无改变。结果体外表达研究结果显示WT—VWF和A1500E突变体VWF的表达上清中VWF：舷的平均含量分别为1．10U／ml和0．78U／ml，突变体细胞裂解液中的VWF：Ag表达量为野生型的90．6％，两者差异均无统计学意义（P〉0．05）。VWF多聚体电泳显示突变体VWF与WT—VWF的多聚体分布亦无明显差别。在无尿素和盐酸胍等变性剂的静态条件下，rADAMTS13即可对A1500E突变体VWF进行有效地水解，VWF多聚体分析显示大中分子量VWF多聚体明显减少和小分子量VWF多聚体明显增多；相反，野生型VWF在非变性条件下则无被rADAMTS13水解的证据。结论A1500E突变导致突变体VWF对ADAMTS13的敏感性异常性增高，符合第二组2A型VWD的突变特点。
- 张敬宇苏健马珍妮董宁征王迎春阮长耿
- 关键词：血管性血友病因子突变血管性血友病血管性血友病因子裂解酶
- Evaluation and clinical application of a new method for detecting ADAMTS13 activity
- 2010年
- 背景 ADAMTS13 活动的严重缺乏贡献 thrombotic thrombocytopenic 紫癜病(TTP ) 的致病。测量 ADAMTS13 的活动在 TTP 病人对 TTP 和预示的监视器的诊断有用。最可得到的试金拖累、昂贵，因此不容易适应了平淡的实验室。ADAMTS13 在领域 A2 以内劈开 von Willebrand 因素(VWF ) ，在领域之间定位了 A1 和 A3。因此，为 ADAMTS13 活动的特定的试金能在劈开前后基于 VWF 的不同结构。用我们试着建立一个新、简单的方法首先决定 ADAMTS13 activity.Methods 的这个假设，血浆样品在使中毒被暴露由 ADAMTS13 允许 VWF 的劈开的状况。然后， ADAMTS13 活动与二新奇 monoclonal 抗体， SZ-129 和 SZ-125 被测量，它明确地由使用二地点的三明治 ELISA 认出 VWF A1 和 A3 领域。与剩余骨胶原绑定试金(R-CBA ) 相比，在 161 件样品的血浆 ADAMTS13 活动被估计，并且在 24 个 TTP 病人的 ADAMTS13 自身抗体的禁止的活动是坚定的。这二试金的关系被线性关联分析，并且新试金的敏感和特性也是在正常的人和 TTP 的 evaluated.Results 血浆 ADAMTS13 活动，尖锐心肌的梗塞( AMI )，并且新试金决定的自发的 thrombocytopenic 紫癜病( ITP )病人是( 89.
- WANG An-you DONG Ning-zheng MA Zhen-ni ZHANG Jing-yu SU Jian RUAN Chang-geng
- 关键词：血管性血友病因子活性检测夹心ELISA活性测定测活
