国家自然科学基金(30000123)
- 作品数：15 被引量：28H指数：3
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- 相关机构：吉林农业大学军事医学科学院解放军军需大学更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 犬冠状病毒V1株膜蛋白基因的克隆与序列分析被引量：3
- 2004年
- 根据GenBank中报道的CCVInsavc 1株核蛋白基因(M)序列,用特异性引物对分离的CCVV1野毒株进行了RT PCR扩增,将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T连接得到重组质粒pTM,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该基因全长为789bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。与CCV标准毒株Insavc 1M基因相比,两者核苷酸的同源性为92.1%;推导的氨基酸序列同源性为90.9%,差异主要发生在该蛋白的N端前1/3区域内。在推导的M蛋白氨基酸序列中,发现了3个明显的疏水区,提示该蛋白可能是一个反复跨膜的蛋白;在N端15～17,38～40,234～236位氨基酸存在3个潜在的N 联糖基化位点,可能是形成该蛋白表面抗原决定基的位点。另外,推导蛋白氨基酸序列的疏水性和抗原表位与Insavc 1株M蛋白存在一定差异,提示两者免疫原性可能有差别。
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- 关键词：犬冠状病毒膜蛋白基因基因克隆
- 大熊猫肝脏分离病毒部分特性的研究被引量：1
- 2005年
- 电镜观察磷钨酸负染的大熊猫肝脏分离病毒细胞培养物,发现冠状病毒样粒子。细胞培养物超薄切片上可见细胞浆内病毒包涵体。理化学和生物学特性研究结果表明,病毒对氯仿、乙醚敏感,可耐受1%胰蛋白酶的作用,具有一定的耐酸性和耐热性;病毒对FCWF细胞敏感,对Vero细胞不敏感,无血凝性和血吸附特性。采用犬冠状病毒阳性血清,经中和试验确定该分离病毒是一株犬冠状病毒,命名为CCVDXMV。以犬冠状病毒特异性PCR引物,可以从大熊猫肝脏组织和不同代次的病毒细胞培养物中,扩增出目的核苷酸片断。序列分析结果表明,该株病毒部分纤突蛋白基因序列与分离自美国的CCVNVSL株相应基因序列的同源性高达100%。
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- 关键词：TCL王牌HID逐行扫描功能物理量行频
- 犬冠状病毒基因重组抗原间接ELISA检测方法的研究被引量：4
- 2004年
- 以在E coli高效表达的犬冠状病毒核蛋白为抗原,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗犬IgG为二抗,建立了检测犬冠状病毒抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定出最佳反应条件为1μg 孔纯化的E coli表达的重组N蛋白抗原包被酶标板,用10%的兔血清进行封闭,以正常E coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明:应用重组N蛋白作为诊断用抗原具有特异性强、稳定性高、成本较低等特点。
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- 关键词：犬冠状病毒间接ELISA
- 犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达被引量：2
- 2004年
- 首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCVlnsavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT-PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCⅤ标准毒株Insavc-lN基因相比,核苷酸的同源性为92 6%,推导的氨基酸的同源性为93 2%。在推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc-l株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IPTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49 3%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。
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- 关键词：核蛋白基因纯化
- 大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析被引量：2
- 2006年
- 从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒,经鉴定为犬冠状病毒(命名为CCVDXMV)。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2,以及半套式引物SF3-SR3、SRI3、SFI3、SF4-SR4和SFI4,分段扩增了CCV DXMV株部分S基因,得到了368 bp、792 bp、737 bp、1 178 bp和985 bp 5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM-T载体中,通过筛选和鉴定,获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序,将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列,拼接成全S基因序列,并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV 79-1 146株的S基因序列进行分析比较,绘制进化树。结果表明,该株病毒与CCV K378株的同源性最高,达到99.4%;而与CCV 23/03株的同源性最低,为56.9%;与FIPV和TGEV分别有90.4%和82.1%的同源性。
- 关振宏胡桂学夏咸柱高凤山逄博乔军
- 关键词：大熊猫犬冠状病毒S基因克隆
- 大熊猫犬冠状病毒在人工感染幼犬组织中的分布
- 将已经分离并完成理化学、生物学、免疫学和基因鉴定的犬冠状病毒(CCV)大熊猫株(CCV DXMV)第8代CRFK细胞培养物、源自美国的犬冠状病毒CCV NL-18参考株和未接毒CRFK细胞冻融物,分别接种三组未吃初乳幼犬...
- 胡桂学逄博夏咸柱高凤山高玉伟
- 文献传递
- 犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究被引量：2
- 2006年
- 以pVAX1为载体首次构建了犬冠状病毒病基因的3种真核表达质粒。首先将犬冠状病毒大熊猫株(CCV DXMV)纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。将测序后的质粒pTS、pTM和pTN分别双酶切,回收目的基因片段并将其定向克隆到真核表达质粒pVAX1中得到重组质粒pVAXS、pVAXM和pVAXN。将这3种真核表达质粒通过脂质体介导法转染MDCK细胞,通过RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白的表达情况。结果在pVAXS、pVAXM、pVAXN转染MDCK细胞36 h后就可检测到目的基因的转录;在转染72 h后可检测到3种目的蛋白的表达。动物免疫试验表明,3种真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫与体液免疫应答,这为CCV基因疫苗的研究奠定了良好的基础。
- 乔军夏咸柱杨松涛郝峰高玉伟郑晓一黄耕
- 关键词：犬冠状病毒免疫原性
- 犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性被引量：1
- 2004年
- 应用 Pichia pastoris 酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV) S 蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出 CCV DXMV 株 S1 基因片断,并将其克隆到 pGEM-T 载体中得到 pTS1。用 Kpn I 和 NotI 双酶切pTS1 回收目的基因 S1 定向克隆到 pPICZαA 中,构建出重组质粒 pPICZαAS1。将 pPICZαAS1 用 Sac I 内切酶线性化后,电转化感受态 GS115 酵母细胞,用 PCR 法筛选阳性重组子。用 1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用 SDS-PAGE 电泳可检测到相对分子量为 106kDa 大小的重组蛋白, Western-blot 证实该重组蛋白可以与 CCV 多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3 株重组酵母菌在 1%甲醇诱导 144h 后,重组蛋白 S1 表达量约占培养物上清总蛋白量的 6.6-8.6%左右。用重组蛋白 S1 免疫 BALB/C 小鼠 3 次后,小鼠血清 CCV 中和抗体可达 1:8-1:16,表明重组 S1 蛋白具有一定的免疫原性。
- 乔军夏咸柱夏咸柱胡桂学杨松涛赵忠鹏谢之景
- 关键词：犬冠状病毒免疫原性
- 犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析
- 2005年
- 首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定。用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果两毒株SM基因ORF全长均为246 bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%9、2.1%和100%、90.9%。DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化。对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低。
- 乔军夏咸柱胡桂学杨松涛谢之景闫芳黄耕
- 关键词：犬冠状病毒分子克隆
- 联合PCR诊断大熊猫犬瘟热和犬冠状病毒的混合感染被引量：9
- 2003年
- 采用一步法提取大熊猫肝脏细胞总RNA,经反转录,选择CDV和CCV联合PCR引物,一次性扩增出CDV和CCV目的片段,进一步证明了大熊猫同时感染了CDV和CCV。
- 高凤山胡桂学夏咸柱柏亚铎余春乔军
- 关键词：大熊猫犬瘟热犬冠状病毒
