国家重点基础研究发展计划(G1999054308-4)
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 相关作者：王万山卢康荣朴英杰朴仲贤顾为望更多>>
- 相关机构：南方医科大学汕头大学中国人民解放军第一军医大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 生长分化因子5基因转染诱导骨髓基质干细胞分化的研究被引量：1
- 2008年
- 目的探讨人生长分化因子5（GDF5）基因转染对骨髓基质干细胞（BMSCs）生长及分化的影响。方法采用脂质体介导法将GDF5基因导入人BMSCs，通过MTT法和流式细胞仪分别检测细胞增殖能力和细胞周期，在光镜和电镜水平观察细胞形态，用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）和免疫细胞化学方法检测GDF5和Ⅱ型胶原mRNA和蛋白质的表达。柠檬酸铅法检测细胞碱性磷酸酶活性，RT—PCR法检测骨钙素mRNA表达。结果GDF5在转染细胞内得到稳定表达，转染细胞的增殖能力和细胞周期与未转染细胞基本一致。光镜下转染细胞中多角形细胞相对增多，排列方式不规则。电镜下转染细胞核呈不规则形，细胞器丰富。转染细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达阳性，骨钙素mRNA表达阴性。结论GDF5基因脂质体法转染BMSCs成功，转染细胞仍保持正常生长增殖特性。GDF5可诱导BMSCs向软骨表型分化，GDF5基因修饰的BMSCs可作为软骨组织工程的候选种子细胞。
- 卢康荣朴仲贤刘真喜王万山顾为望朴英杰
- 关键词：基因骨髓细胞转染分化
- GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的克隆人软骨组织生长分化因子5(GDF5)基因及构建GDF5基因真核表达载体,观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA,插入pEGFP-C2载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5,克隆在载体上的基因长度为1 505 bp,包含全部cDNA编码序列1505 bp,测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达,绿色荧光蛋白在转染24 h后开始表达,72 h达高峰,然后表达逐渐减弱。转染后72 h可检测到GDF5 mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。
- 王万山顾为望朴仲贤卢康荣
- 关键词：生长分化因子5克隆间充质干细胞恒河猴胎儿
- 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对T47D乳腺癌细胞生物学行为的影响被引量：2
- 2010年
- 目的探讨去甲基化5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对T47D乳腺癌细胞株生长周期及凋亡的影响。方法分别使用浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、25.0、100.0μmol/L 5-Aza-CdR处理T47D细胞株。MTT法检测T47D细胞存活率。流式细胞仪检测T47D细胞生长周期,观察细胞凋亡情况。RT-PCR法检测处理前后抑癌基因p16 mR-NA表达。结果5-Aza-CdR作用后T47D细胞明显受抑,G0/G1期细胞明显增多,细胞阻滞于G1期,凋亡率明显增高;5-Aza-CdR处理后无p16表达的T47D细胞检测出p16基因的重新表达。结论5-Aza-CdR可抑制T47D细胞的生长,并促进其凋亡;其机制可能为消除某些抑癌基因启动子甲基化。
- 卢康荣周娅孙建聪薛侠马文峰王万山
- 关键词：细胞周期细胞凋亡
- BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞被引量：7
- 2004年
- 目的:研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法:通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中,诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞;在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果:光镜下,诱导后的细胞形态发生明显改变;RT-PCR结果表明,诱导后的细胞有BMP12和CollagenⅠ的mRNA的表达,而没有CollagenⅢ的mRNA表达;诱导后细胞呈CD44+为98.39%,HLA-DR-。结论:BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞,间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。
- 王启伟朴英杰
- 关键词：间充质干细胞定向分化基因转染腱细胞
- 生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性
- 2009年
- 背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18～22g,6～8周龄。方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。结果:RT-PCR产物长约350bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。
- 卢康荣王万山薛侠朴仲贤朴英杰
- 关键词：生长分化因子5克隆活性
