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BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究被引量：7: 2013年; 旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。; 施青青张振韬李鹏程郑蒙蒙王丹黄晓梅张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化 BMP4

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索被引量：2: 2012年; 分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。; 张亚妮杨海燕施青青张振韬郑蒙蒙王丹李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞显微注射

蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控被引量：1: 2016年; 【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓; 李东汤贝贝王颖洁纪艳芹王飞路镇宇王曼张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞原始生殖细胞精原干细胞雄性生殖细胞

鸡胚ESC和SSCs特定基因表达差异的研究被引量：3: 2011年; 目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异。方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异。结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因。结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据。; 孙敏施青青傅德智阴彦辉张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞基因表达

如皋黄鸡功能未知基因C1EIP表达载体的构建及其抗小鼠血清制备被引量：1: 2017年; 为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清。间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础。; 李东王飞纪艳芹汪怡临王曼张晨王颖洁何娜娜靳锴路镇宇程少泽张亚妮李碧春; 关键词：如皋黄鸡真核表达抗血清

鸡胚原始生殖细胞生物学特性鉴定及相关基因表达研究被引量：2: 2012年; 采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5～6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。; 施青青孙敏郑蒙蒙王丹黄晓梅张亚妮李碧春; 关键词：体外培养生物学特性

鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立及其转染体系的优化被引量：2: 2013年; 鸡胚胎干细胞(cES)以其全能性,在研究胚胎发育生物学和家禽育种等方面有巨大的应用前景。本实验旨在建立cES无饲养层培养体系和对LipofactiminTMLTX(脂质体)介导转染体系进行优化。采用药匙法从新鲜受精蛋中分离获取cES,接种于层粘连蛋白包被的培养皿,待形成大克隆后,用口吸管剥离法吸取cES克隆进行消化传代,并采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞活性。设计质粒量800、900、1 000 ng 3个水平,质粒、脂质体比为1∶1.5、1∶2、1∶2.5体系转染cES。结果表明:无饲养层培养体系体外培养cES细胞能稳定传代至第6代,鉴定结果显示碱性磷酸酶阳性和阶段特异性胚胎抗原1阳性,指明克隆能保持未分化状态;质粒900 ng、质脂比为1∶2时,可获得最佳转染效率72%,为cES的脂质体介导外源基因的转染提供参考。; 郑蒙蒙李伟张亚妮施青青王丹李碧春; 关键词：胚胎干细胞脂质体

胚胎干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展被引量：2: 2012年; 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)具有自我更新及无限分化潜能,理论上可以分化为生殖细胞。目前,在人及鼠中已有体外诱导ES细胞分化为成熟精子的报道。系统阐述影响ES细胞分化为雄性生殖细胞的内源性及外源性因素,并结合国内外最新研究进展总结其诱导分化方法,展望应用前景,期望为从事相关研究的学者提供参考。; 孙敏施青青李碧春; 关键词：胚胎干细胞雄性生殖细胞

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国家教育部博士点基金(20103250110006)

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