国家自然科学基金(30500501)
- 作品数：7 被引量：4H指数：1
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- 人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性被引量：3
- 2009年
- 目的:真核表达人ICOS胞外区与IgGFc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgGFc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgGFc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。
- 张鹏秦琴王振猛王健沈茜
- 关键词：真核表达淋巴细胞增殖
- MHCII类分子反式激活因子突变体重组腺病毒治疗小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎
- 2008年
- 评估IFN-γ调控型启动子(CIITA-pIV)驱动的MHC II类分子反式激活因子突变体(MHC class II transactivator mu-tant,CIITAm)重组腺病毒Ad-pIV-CIITAm对小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。34只健康雌性CBA/J小鼠随机分成CIITAm治疗组(n=9)、GFP对照组(n=9)、EAT模型组(n=8)和正常对照组(n=8)共四组。正常对照组不做特殊处理,其余三组均以猪甲状腺球蛋白(porcinethyroglobulin,pTg)+弗氏佐剂(complete or incomplete Freund adjuvant,CFA/IFA)建立EAT小鼠模型,并分别静脉注射重组腺病毒Ad-pIV-CIITAm、Ad-GFP及等体积生理盐水。首次免疫后第29天处死小鼠,进行H-E染色观察甲状腺病理形态;免疫组织化学染色测定甲状腺MHC II类分子表达;分析pTg刺激下脾脏淋巴细胞的增殖及其上清液中IFN-γ的分泌水平;ELISA法检测血浆中抗-pTg自身抗体滴度;流式细胞术分析外周血和脾脏淋巴细胞中T细胞亚群。结果:H-E染色结果表明,CIITAm治疗组甲状腺淋巴细胞浸润指数(0.5±0.5)低于GFP对照组(1.5±0.2)和EAT模型组(1.4±0.4,P<0.01)。免疫组化结果显示,GFP对照组和EAT模型组甲状腺组织有弥漫性MHC II类分子表达,而CIITAm治疗组未见明显表达,正常对照组表达呈阴性。80μg/ml pTg刺激下,CIITAm治疗组小鼠淋巴细胞刺激指数(SI)明显低于GFP对照组或EAT模型组(P<0.01);培养上清各组IFN-γ分泌水平结果类似(P<0.01)。CIITAm治疗组血浆抗-pTg自身抗体滴度显著低于GFP对照组或EAT模型组(P<0.05);CIITAm治疗组外周血和脾脏CD4+T细胞百分率亦显著低于GFP对照组或EAT模型组(P<0.05)。重组腺病毒Ad-pIV-CIITAm能抑制EAT小鼠甲状腺组织MHC II类分子表达,抑制自身反应性T细胞增殖,减轻甲状腺炎性细胞浸润,降低自身抗体滴度,对EAT有一定的治疗作用。
- 龙宪连管政张军沈茜
- 关键词：腺病毒科自身免疫性甲状腺炎基因治疗Γ干扰素
- 可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性分析
- 2010年
- 目的对自行研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性进行分析鉴定。方法采用HCl水解法、Edman法、胰酶消化MALDI-TOF-MS质谱法分别测定该融合蛋白的氨基酸组成、N末端15个氨基酸序列、肽谱等理化性质,并通过CFSE标记体内检测淋巴细胞增殖反应实验研究其抑制同种淋巴细胞增殖的生物学活性。结果氨基酸组成分析测得样品的氨基酸组成与ICOS-Ig理论值基本一致。蛋白N末端15个氨基酸序列为EINGSANYEM-FIFHN,与ICOS-Ig理论值一致。MALDI-TOF-MS质谱测定共获得6个与理论预测值相符的肽段。ICOS-Ig可以明显抑制同种T细胞的体内增殖反应。结论所研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白结构表达正确且具有体内抑制同种淋巴细胞增殖的活性,为该融合蛋白的质量标准研究奠定了基础。
- 张鹏王振猛秦琴王健沈茜
- 关键词：氨基酸组成肽谱淋巴细胞增殖
- 小鼠pIV启动子调控CⅡTA突变体重组腺病毒表达选择性抑制MHC Ⅱ类分子的表达
- 2008年
- 目的:观察受CⅡTA-pIV启动子驱动的MHCⅡ类分子反式激活因子突变体(CⅡTAm)重组腺病毒对MHC Ⅱ类分子表达的选择性抑制作用,并探讨其相关机制。方法:构建了N-端酸性氨基酸区缺失了118aa的CⅡTA突变体及其CⅡ TA-pIV启动子驱动的重组腺病毒Ad-pIV-CⅡTAm,将Ad-pIV-CⅡTAm或对照腺病毒Ad-GFP感染小鼠内皮细胞株SVEC细胞和转染巨噬细胞株J774细胞,并以IFN-γ刺激。用RT-PCR检测野生型和突变型CⅡTA mRNA的表达,用流式细胞术检测MHC Ⅱ类分子在细胞表面的表达。结果:成功构建CⅡTA-pIV启动子调控下的CⅡTA突变体基因重组腺病毒表达载体Ad-pIV-CⅡ TAm;该腺病毒介导的CⅡTA突变体mRNA在SVEC和J774细胞内的表达受到IFN-γ的上调,同时抑制这些细胞上诱导型和组成型MHC Ⅱ类分子的表达。结论:Ad-pIV-CⅡTAm重组腺病毒是一种IFN-γ调控型表达载体,可有效地抑制受感染细胞上 MHC Ⅱ类分子的表达。
- 龙宪连管政张军方超平张薇薇张倩沈茜
- 关键词：腺病毒科MHC
- 可溶性HVEM-Ig融合蛋白的真核表达、鉴定、纯化及生物学活性检测被引量：1
- 2009年
- 目的:构建含鼠疱疹病毒侵入介质(herpesvirus entry mediator,HVEM)胞外区和IgG2aFc段重组表达质粒,真核表达HVEM-Ig融合蛋白,鉴定、纯化,并检测其生物学活性。方法:通过RT-PCR从BALB/c小鼠脾细胞总RNA中扩增HVEM胞外区片段,WT-1杂交瘤细胞总RNA中扩增鼠IgG2aFc片段,克隆入真核分泌型表达载体pSecTag2A,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),表达产物用rProteinA凝胶进行亲和层析纯化,获得目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western印迹分析。在单向混合淋巴细胞反应中加入不同浓度的HVEM-Ig融合蛋白作为处理组,同时以加入IgG蛋白的作为阴性对照和未处理的混合淋巴细胞作为空白对照,分别采用[3H]-TdR掺入法和ELISA法观察淋巴细胞增殖程度和细胞因子分泌情况。结果:成功构建重组质粒pSecTag2A-HVEM-Ig,表达及纯化HVEM-Ig融合蛋白,并对蛋白的理化性质进行了鉴定。[3H]-TdR掺入法和ELISA法结果显示:与对照组相比,该融合蛋白呈剂量依赖性抑制淋巴细胞增殖和IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的分泌(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建了HVEM-Ig融合蛋白真核表达体系,融合蛋白具有预期的抑制淋巴细胞活性及细胞因子分泌的功能,为后续研究该分子在自身免疫和移植免疫反应中的机制奠定了基础。
- 秦琴张鹏唐古生沈茜
- 关键词：免疫球蛋白G融合蛋白转染
- ICOS—Ig融合蛋白联合亚剂量环孢素A诱导小鼠移植心脏长期存活
- 2010年
- 目的 探讨可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白（ICOS-Ig）联合亚剂量环孢素A（CsA）对小鼠移植心脏存活时间的影响及其机制。方法自行构建ICOS-Ig。以Balb／c小鼠为供者，C57BL／6小鼠为受者，套管法制备小鼠颈部心脏移植模型，然后将模型分为5组：（1）未处理组，不做任何处理；（2）对照IgG组，移植当天以及术后第2、4、6天腹腔注射IgG250μg；（3）ICOS-Ig组，移植当天以及术后第2、4、6天腹腔注射ICOSylg250μg；（4）CsA组，移植当天以及术后第1～7天腹腔注射CsA10mg／kg；（5）ICOS-Ig＋CsA组，同时给予ICOS-Ig和CsA，使用时间和剂量同前。术后观察移植心脏存活时间，观察移植后第7天移植心脏的病理变化，并进行供、受者混合淋巴细胞反应（MLR），测定受者血清中供者特异性的同种抗体水平。结果各组小鼠移植心脏存活时间分别为：未处理组（8．5±1．5）d，对照IgG组（8．0±0．8）d，ICOS-Ig组（29．5±7．7）d，CsA处理组（21．0±5．0）d，ICOS-Ig＋CsA组移植心脏存活时间均超过50d，6只（6／9）移植心脏存活时间〉100d，ICOS-Ig＋CsA组与其他4组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。移植后7d，未处理组及对照IgG组心肌明显变性，纤维断裂，间质水肿，肌束间及血管周嗣有大量炎症细胞浸润，而ICOS-Ig组和CsA组心肌无明显变性，间质略水肿，血管周围有少量淋巴细胞浸润，ICOS-Ig＋CsA组的病理改变明显轻于ICOS-Ig组和CsA组。移植后7d，ICOSylg组和CsA组的脾脏淋巴细胞对同种抗原刺激反应比未处理组和对照IgG组明显降低（P〈0．05），而ICOS-Ig＋CsA组的抑制作用明显强于ICOS-Ig组和CsA组（P＜0．05）。移植后7d，ICOS-Ig组和CsA组受者血清中针对特异性供者的抗体水平明显低于未处理组和对照IgG组（P〈0．05），ICOS-Ig＋CsA组的抗体水平明显低于ICOS-Ig组和CsA组（P〈0．05）。结
- 张鹏王振猛秦琴唐乙王全兴沈茜
- 关键词：可诱导共刺激分子重组融合蛋白质类移植物存活小鼠
- 可诱导共刺激分子与人IgGFc融合蛋白诱导同种免疫低应答的体内外实验
- 2009年
- 目的探讨真核表达人可诱导共刺激分子（ICOS）与人IgGFc融合蛋白（ICOS-Ig融合蛋白）在体内外对同种免疫应答的影响。方法构建ICOS-Ig融合蛋白表达载体，在CHO细胞中表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。以Balb／c小鼠脾细胞为反应细胞，经CO^60照射灭活的C57BL／6小鼠脾细胞为刺激细胞，进行初次混合淋巴细胞反应（MLR），MLR体系中分别加入50μg／ml ICOS-Ig融合蛋白（ICOS-Ig组）或对照IgG（IgG组），采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR）掺入法检测反应细胞的增殖情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中白细胞介素（IL）2、4、10以及γ干扰素（IFN-γ）的含量。收集初次MLR细胞，与灭活的C57BL／6小鼠脾细胞或C3H小鼠脾细胞共培养，进行再次MLR，检测指标同初次MLR。以Co^60照射Balb／c小鼠，经尾静脉输注用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记的C578126小鼠脾细胞，每天腹腔注射ICOS-Ig融合蛋白0．2mg（ICOS-Ig组）、IgG（对照IgG组）或环孢素A（CsA组），3d后取Balb／c小鼠脾细胞，流式细胞仪测定CFSE荧光强度以判断同种T淋巴细胞的体内增殖情况。结果初次MLR显示，ICOS-Ig组同种T淋巴细胞活化增殖的抑制率为（58±8）％，其培养上清液中IFN-γ的水平明显高于IgG组（P〈0．05）。再次MLR显示，ICOS-Ig融合蛋白能特异性抑制C57BL／6小鼠脾细胞所致的细胞增殖，抑制率为（42±8）％，IL-4和IL-10的分泌受到抑制，而IFN-γ的分泌增加；ICOS-Ig融合蛋白并不抑制第三方细胞所致的细胞增殖。体内实验显示，ICOS-Ig组和CsA组的CFSE荧光强度明显强于空白对照组和对照IgG组（P〈0．05），而联合处理组CFSE荧光强度强于ICOS-Ig组和CsA组（P〈0．05）。结论ICOS-Ig融合蛋白在体内外均可抑制同种T淋巴细胞的活化增殖，且这种作用具有特异性。
- 张鹏秦琴王振猛沈茜
- 关键词：重组融合蛋白质类免疫抑制法淋巴细胞培养试验
